سلولز

۵/۴۲%

همی سلولز

۷/۳۳%

لیگنین

۲۳%

۴-۳- بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر تولید پروتئین
۴-۳-۱- بررسی تأثیر نوع بافر استخراج
قدم اول در آماده سازی نمونه، استخراج پروتئین ها از منبع مورد نظر است. ممکن است استخراج پروتئین ها مستقیماًتوسط بافر محلول ساز^[۷۹]صورت پذیرد و یا ممکن است این عمل توسط روش های متلاشی ساختن سلولها^[۸۰]و بافتها انجام شود و سپس پروتئین های استخراج شده در بافر محلول ساز کاملاً حل شوند. روش های آماده سازی مطلوب برای نمونه های بدست آمده از منابع متفاوت اختلاف زیادی با یکدیگر دارند. این امر به خاطر ماهیت و ساختار این منابع است. نمونه های جامد معمولاً درحضور بافر محلول ساز از هم می پاشند. سلولهایی نظیر سلولهای بافتی کشت داده شده، سلولهای خونی و برخی از میکروارگانیسمهاحاوی سلولهایی است که به راحتی لیز^[۸۱] می شوند. ممکن است لیز سلولی به طور مستقیم در تماس با بافر محلول ساز صورت پذیرد یا در مواردی ممکن است از امواج مافوق صوت^[۸۲] برای این منظور استفاده شود. حتی در برخی موارد ترکیبی از روش های مختلف برای نیل به استخراج کامل پروتئین های نمونه استفاده می گردد. اما در بیشتر موارد سلولها مستقیماً در بافر محلول ساز لیز می شوند، چرا که این بافر ها همیشه دارای دترجنت هستند. بنابراین چون نمونه مورد نظر ما از نوع نمونه های جامد و حاوی سلول های میکروارگانیسم بوده است برای استخراج پروتئین های آن از بافرهای استخراج مختلف استفاده شد.به منظور بررسی این پارامتر بافر ۱/۰ مولار فسفات )۷ (pH=بافر ۱/۰ مولار سیترات )۵ (pH=بافر ۲/۰ مولار کربنات-بی کربنات

)۱۰ (pH=و آب مقطر برای استخراج پروتئین استفاده شد.
باید توجه داشت در این مرحله برای هر بافر، شاهدی استفاده شود که متشکل از همان بافر و معرف برد فورد باشد. سپس با قرار دادن میزان جذب نمونه ها در معادلات بدست آمده، میزان پروتئین برای بافر سیترات، کربنات-بی کربنات، فسفات و آب مقطر به ترتیب ۱۹۸/۵، ۴۹۴/۱۱، ۸۴۰/۴ و ۴۵۲/۳ میلی گرم پروتئین بر گرم نمونه محاسبه شد. با توجه به نتایج بدست آمده بافر کربنات-بی کربنات برای استخراج پروتئین برای ادامه کار انتخاب شد.Anupama و Ravindra (۲۰۰۱) نیز پس از بررسی بافرهای سیترات، کربنات-بی کربنات و فسفات میزان پروتئین حاصل از آن ها را به ترتیب ۴۰۳/۳، ۸۸۴/۶ و ۳۵۱/۶ میلی گرم پروتئین بر گرم نمونه گزارش کردند. آن ها همچنین از سدیم هیدروکسید (N۱/۰) نیز برای استخراج پروتئین از نمونه استفاده کردند و به میزان ۱۵۴/۳ میلی گرم پروتئین بر گرم نمونه پروتئین دست یافتند ]۷۳[.
۴-۳-۲- بررسی تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا
رطوبت های اولیه ۳۰ تا ۹۰% برای این آزمایش در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد و رطوبت بیورآکتور ۸۵% به مدت ۴۸ ساعت مورد بررسی قرار گرفت و داده ها در شکل۱-۴ ارائه گردید. مشاهده شد که رطوبت اولیه ۷۰% هم برای سینی بالایی و هم برای سینی میانی منجر به تولید بیشترین میزان پروتئین شد. لازم به ذکر است که رطوبت اولیه باگاس توسط تزریق محیط کشت حاوی مخمر به محیط جامد تأمین می شد. افزایش رطوبت اولیه از ۳۰ تا ۷۰% با عث افزایش در تولید پروتئین گردید. زیرا کاهش رطوبت موجب کاهش در دسترس بودن مواد مغذی برای میکروارگانیسم ها شده و میزان تولید کم تر شد اما افزایش رطوبت و افزایش فعالیت آبی و دسترسی بیش تر میکروارگانیسم ها به مواد مغذی موجب شد تا تولید پروتئین با سهولت بیشتری امکان پذیرد. با این وجود افزایش رطوبت اولیه در سینی ها از ۷۰ تا ۹۰% موجب فشرده شدن ذرات باگاس شده که منجر به کاهش فضای ذرات و کاهش انتشار مواد مغذی شده و در نهایت کاهش تولید پروتئین گردید. همچنین از نتایج بدست آمده مشخص شد که میزان تولید پروتئین در نمونه های سینی بالایی بیشتر از سینی میانی بوده است. همان طور که گفته شد سینی بالایی محلول مواد مغذی را به طور مستقیم از نازل دریافت می کرد، در حالیکه سینی میانی مایعی را که از لابلای منافذ سینی بالایی بر روی آن ریخته می شد را دریافت می کرد. بنابراین نمونه های باگاسی که در سینی بالایی واقع شده بودند ممکن است مواد مغذی بیشتری را مصرف کرده و در نتیجه قادر به تولید پروتئین بیشتری بودند.Thanapimmetha و همکارانش (۲۰۱۲) نیز در تخمیر حالت جامد بر روی ذرت از رطوبت اولیه ۵/۷۷% برای تخمیر استفاده کردند ]۷۴[.
شکل ۴-۱: تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا بر تولید SCPاز ساکرومایسیس سرویسیه
۴-۳-۳- بررسی تأثیر مدت زمان تخمیر
به منظور بررسی این پارامتر به فاصله زمانی ۲۴ ساعت و در دماهای ۲۵، ۳۰ و ۳۵ درجه سانتی گراد و رطوبت ۸۵% به مدت ۹۶ ساعت از سینی ها نمونه گیری انجام شد که نتایج حاصل از این بررسی در
جدول ۴-۲ ارائه شده است. پس از استخراج و اندازه گیری پروتئین تولید شده تحت شرایط ذکر شده، در تمامی دماهای مورد بررسی بیشترین میزان تولید پروتئین پس از گذشت ۷۲ ساعت مشاهده شد. پس از آن پروتئین تولیدی کاهش پیدا کرد. علت این امر این است که در مدت ۷۲ ساعت میکروارگانیسم ها خود را با شرایط داخل بیورآکتور از قبیل درجه حرارت و رطوبت داخلی وفق داده و مواد مغذی موجود در باگاس و محلول در حال گردش را استفاده کرده و پروتئین بیش تری تولید شد. اما پس از آن به دلیل کاهش مقدار مواد مغذی برای رشد میکروارگانیسم ها میزان تولید پروتئین کاهش یافت. Singh و همکارانش (۱۹۹۱) با بهره گرفتن از آسپرژیلوس نایجر و ضایعات ذرت در مدت ۶ روز به میزان ۱۷۵/۰ گرم پروتئین بر گرم سوبسترا دست یافتند ]۷۵[. Jaganmohan و همکارانش (۲۰۱۳) مدت ۵ روز را برای تولید پروتئین تک یاخته در تخمیر حالت جامد با بهره گرفتن از میکروارگانیسم آسپرژیلوس ترئوس^[۸۳] و ضایعات موز گزارش کردند ]۷۶[. نتایج همچنین نشان می دهد که با افزایش دمای محفظه داخلی بیورآکتور از ۲۵ تا ۳۵ درجه سانتی گراد هم برای سینی بالا و هم برای سینی پایین تولید پروتئین افزایش یافته است که جزئیات این مبحث در بخش بعدی توضیح داده خواهد شد. از آن جایی که پروتئین تولیدی در سینی پایینی نسبت به سینی های بالایی و میانی بسیار کمتر بود، برای مطالعات بعدی در نظر گرفته نشد.
جدول ۴-۲: تأثیر مدت زمان تخمیر بر تولید پروتئین تک یاخته از ساکرومایسیس سرویسیه

زمان (h)

۲۴

۴۸

۷۲

۹۶

دما(°C)

۲۵

سینی بالا