رنگ متیلن بلو ۱۰ درصد جهت رنگ آمیزی مغز ها
۳-۷-طرز تهیه محلول ها
داروی D-AP5 در داخل سرم فیزیولوژیک ۹/۰ در صد حل شد .داروی AM930 در سرم فیزیولوژی به اضافه۱۰ درصد DMSO و همچنین GP1a در سرم فیزیولوژیک به اضافه ۲۰درصد DMSO حل گردید.
۳-۸- دستگاه بررسی حافظه( Step-Through)
دستگاه یادگیری اجتنابی مهاری (غیرفعال)^[۲۹] ، مدل Step-Through، از جعبه ای تشکیل شده که به وسیله یک دیواره به دو قسمت با اندازه یکسان (۲۰×۲۰×۳۰ سانتیمتر) تقسیم می شود. درون دیوار بین دو قسمت درب گیوتینی به ابعاد ۹×۷ سانتیمتر تعبیه شده است که می توان در موقع لزوم آنرا برداشت. این دستگاه دارای بخشی سفید می باشد که کف و دیواره های آن از جنس پلکسی گلاکس سفید ساخته شده و فاقد سقف بوده که توسط نور غیر مستقیم لامپ مهتابی زرد رنگ روشن می شود. بخش دیگر دستگاه سیاه رنگ است در کف این قسمت میله های فولادی با فاصله یک سانتیمتر از هم قرار می گیرند که این میله ها توسط سیم رابطی به دستگاه استیمولاتور متصل می شوند و عمل انتقال شوک الکتریکی به حیوانات مورد آزمایش را ممکن می سازند. اتاق آزمایش باید نسبتا تاریک و بدون سر و صدا باشد(شکل ۳-۱).
شکل۳-۱:دستگاه تست حافظه Step-Though
۳-۹- حیوانها
در آزمایش ها از موش رت نر نژاد ویستار به وزن تقریبی ۲۳۰-۲۵۰ گرم استفاده می گردد. در طول آزمایش ها آب و غذای کافی در اختیار موش ها قرار می گرفت و هر سه روز یکبار قفس موشها تمیز می شد دما در حیوانخانه بین ۳±۲۲ درجه سانتیگراد متغیر بوده است. به مدت یک هفته به موشها اجازه داده می شود که خود را با شرایط حیوانخانه قبل از جراحی وفق بدهند در طول یک هفته هر روز حیوانها Handling می شدند تا در موقع آزمایش استرس ناشی از گرفتن و کار با آنها وجود نداشته باشد هر حیوان فقط یکبار استفاده می شد و در هر گروه هشت حیوان قرار داده شد. تمام آزمایش ها در طول روز انجام می شدند.
۳-۱۰- مراحل جراحی
حیوانها توسط تزریق درون صفاقی^[۳۰] کتامین حیوانی^[۳۱] ۱۰ درصد به میزان(m lit/kg2) بیهوش می شدند.
برای جلوگیری از سفتی عضلات در هنگام بیهوشی زایلزین با کتامین به ترتیب با نسبت ۱ به۴ قبل از تزریق مخلوط شدند. بعد از بیهوشی حیوان موهای روی سر از فاصله بین دو چشم تا دو تا گوش چیده شده و حیوان در دستگاه استریوتاکسی قرار می گرفت(در این وضعیت میله های گوشی^[۳۲]در فرورفتگی مربوط به صندوق صماخی و دندانهای پیشین در داخل سوراخ میله دندانی^[۳۳] جاسازی می شوند(شکل ۳-۲).

شکل۳-۲:جا انداختن سر موش در دستگاه
بر طبق اطلس پاکسینوس و واتسون میله دندانی باید در حدود ۳/۳ میلیمتر زیر صفر باشد که سطح جمجمه در داخل دستگاه کاملا افقی باشد. با پنبه آغشته به بتادین این محل ضد عفونی شده و توسط تیغ جراحی استریل یک برش از فاصله بین چشمها تا گوشها در قسمت وسط (در امتداد شیار ساجیتال میانی جمجمه) داده میشد.بعد از برش با کنار زدن پوست سر، بوسیله پنبه و الکل سفید تمام چربیهایی که بین پوست و استخوان جمجمه است کاملا برداشته میشد و پس از خشک شدن کامل سطح جمجمه دو نقطه برگما^[۳۴] (محل تقاطع درز تاجی^[۳۵] و درز سهمی^[۳۶])، لامدا^[۳۷] و خط وسط آن کاملا مشخص شود(شکل۲-۳).
با بهره گرفتن از اطلس پاکسینوس و واتسون (۱۹۸۶) مشخصات منطقه CA1 هیپوکامپ تعیین می شد (ML=±۲, AP=-3.3, V=-1.8)، چون این اعداد برای موشهای با برگما، لامدا ۹ است با بهره گرفتن از تناسب تمام اعداد مربوط به موشهای با برگما –لامدا پایین تر محاسبه می شد. بعد با بهره گرفتن از مته به دقت این مکان ها سوراخ می گردید.
بعد از این کار با بهره گرفتن از دستگاه استریوتاکسی دو کانول (Gauage 22) به طول ۸ میلیمتر در داخل سوراخهایی که قبلا توسط مته ۷/۰ ایجاد شده بود قرار می گرفت. البته این کار به طور همزمان صورت نمیگیرد اول کانول سمت چپ در مکان خود طبق نقشه قرار می گرفت. بعد بوسیله آکریل و مونومر دندانپزشکی یک سیمان که نه خیلی سفت باشد و نه خیلی شل درست کرده و در کنار کانول قرار داده می شد که دور تا دور آنرا فرا گیرد و لازم است سیمان کاملا سفت شود(شکل ۳-۳و۳-۴)
شکل۳-۳:قرار دادن کانول اول در محل خود
شکل۳-۴:ریختن سیمان در اطراف کانول اول
بعد از اینکه سیمان کاملا سفت شد کانول دیگر را در جای خود قرار داده و با ریختن سیمان در اطراف کانول و تمام سطح جمجمه هر دو کانول محکم به سطح جمجمه اتصال داده می شوند(شکل۳-۵).
شکل ۳-۵:گذاشتن کانول دوم و پرکردن آن با سیمان دندان پزشکی
این کانولها یک میلیمتر بالاتر از منطقه CA1 هیپوکامپ هستند. برای جلوگیری از بسته شدن کانولها یک سیم نازک استریل شده را در داخل کانولها قرار داده میشد تا از مسدود شدن کانولها در طول آزمایش جلوگیری کند. بعد از جراحی و قبل از تزریق درون مغزی دارو داخل کانولها به حیوان ۵ تا ۷ روز استراحت^[۳۸] داده میشد تا استرس و تخریب بافتی احتمالی که توسط جراحی صورت گرفته است از بین برود و حیوان به حالت عادی خود برگردد.
۳-۱۱- تزریق درون مغزی دارو
برای تزریق دارو از کانول ۲۷ گیج دندانپزشکی به طول ۹ میلیمتر استفاده شد که یک میلیمتر بزرگتر از کانول راهنما است و دقیقا به CA1 رسیده ولی به آن آسیب نمی زند. این سر سوزن توسط چسب قطره ای به کت دان تیوپ^[۳۹] نوزاد اندازه ۴ متصل میشد. برای تزریق از سرنگ هامیلتون ۲ میکرولیتر استفاده شد و مراحل تزریق به این ترتیب بود که بعد از برداشتن سیم داخل کانول راهنما، سر سوزن ۲۷ دندانپزشکی را در داخل کانول راهنما ۲۲ قرار داده و در هر کانول ۵/۰ میکرولیتر از دارو را به مدت ۶۰-۹۰ ثانیه تزریق میشد این زمان بدین منظور است که دارو در مغز وارد شده و از کانول راهنما بیرون نیاید و در مجموع به هر موش ۱ میکرولیتر دارو درون مغزی تزریق می شود. در طول تزریق به حیوان اجازه داده میشود بدون هیچ استرسی آزادانه حرکت کند شکل(۳-۶).
شکل (۶-۳): تزریق داخل مغزی(i.c.v.) دارو به وسیله سرنگ هامیلتون
۳-۱۲- تستهای رفتاری
روش اجتنابی مهاری برای بررسی حافظه در موشهای آزمایشگاهی در دو روز پشت سر هم انجام می شود. روز اول یا روز آموزش^[۴۰] شامل آموزش دادن حیوانها در دستگاه می باشد و روز دوم، روز آزمون^[۴۱] یا تست کردن میزان حافظه ی حیوانهای آموزش دیده است.
۳-۱۲-۱ مرحله آموزش
در روش اجتنابی مهاری مدل Step-Throuth ، هر حیوان به آرامی در بخش روشن دستگاه قرار می گیرد و به مدت ۵ ثانیه به آن اجازه داده می شود که در این قسمت بمانند تا با آن آشنا شوند. بعد از گذشت ۵ ثانیه درب گیوتینی باز شده و به حیوان اجازه داده می شود از این قسمت وارد قسمت سیاه شود بلافاصله بعد از ورود حیوان به خانه سیاه درب گیوتینی بسته شده و ۱۰ ثانیه به حیوان فرصت داده می شود تا با محیط مذکور آشنا شود بعد از ۱۰ ثانیه به آرامی حیوان به قفس نگهدارنده برگردانده می شود. با توجه به تمایل ذاتی حیوانها برای ورود به بخش تاریک، بعد از مدتی زمانی اندک موش از بخش روشن وارد بخش تاریک دستگاه می شود. موشهایی که بیشتر از ۱۲۰ ثانیه در ورود به بخش تاریک تاخیر داشته باشند از ادامه آزمایش حذف می شوند.پس از گذشت ۳۰ دقیقه این حیوان دوباره به بخش سفید دستگاه منتقل شده و بعد از ۵ ثانیه درب گیوتینی باز شده تا حیوان وارد بخش تاریک شود. با ورود حیوان به بخش تاریک، درب گیوتینی پشت سرش بسته شده و حیوان تحریک الکتریکی با شدت یک میلی آمپر و به مدت ۳ ثانیه، که توسط استیمولاتور به میله های فولادی کف بخش تاریک منتقل می شود، را دریافت می کند. با توجه به بسته بودن سقف این بخش حیوان نمی تواند از شوک الکتریکی اجتناب کند(شوک اجتناب ناپذیر). ۲۰ ثانیه بعد از پایان تحریک حیوان از دستگاه خارج شده و به قفس نگهداریش منتقل می شود. پس از گذشت ۲ دقیقه مرحله دوم آموزش روش موش شوک گرفته انجام می شود در این مرحله موش مانند دفعات قبل به خانه سفید دستگاه منتقل شده و درب گیوتینی باز می شود و میزان تاخیر ورود به بخش تاریک ثبت می گردد. چنانچه موش به میزان ۱۲۰ ثانیه در ورود به بخش سیاه تاخیر داشته باشد اصطلاحا یادگیری موفق^[۴۲] برایش ثبت می گردد و از دستگاه خارج شده بلافاصله تزریق بعد از آموزش۱ را دریافت می کند. اما اگر موش در ورود به بخش تاریک کمتر از ۱۲۰ ثانیه تاخیر داشته باشد، پس از ورود به بخش تاریک درب گیوتینی بسته پشت سرش بسته شده و برای بار دوم شوک دریافت می کند و پس از خارج کردن آن از دستگاه و گذشت ۲ دقیقه دوباره مورد امتحان قرار می گیرد. در صورت کسب یادگیری موفق از دستگاه  خارج شده و تزریق بعد از آموزش را دریافت می کند. حداکثر آموزش برای هر موش سه بار در نظر گرفته می شود.
شکل ۳-۷:با باز شدن درب گیوتینی بین محفظه سفید و سیاه موش وارد قسمت سیاه شده و شوک دریافت می کند.
۳-۱۲-۲- مرحله آزمون یا بررسی حافظه
مرحله آزمون ۲۴ ساعته بعد از مرحله آموزش انجام می شود. در جلسه آزمون تحریک الکتریکی انجام نمی شود. برای بررسی حافظه، هر موش بعد از دریافت تزریق قبل از آزمون همانند روز اول در بخش روشن دستگاه قرار می گیرند، درب گیوتینی بعد از ۵ ثانیه باز شده و زمان تاخیر حیوان در ورود به بخش تاریک دستگاه بعنوان معیاری برای بررسی میزان حافظه در نظر گرفته می شود. بیشترین مقدار تاخیر برای ورود به بخش تاریک ۳۰۰ ثانیه در نظر گرفته می شود. موشی که به خاطر می آورد که در بخش تاریک دستگاه شوک گرفته است و می تواند تمایلش را برای ورود به بخش تاریک مهار کند و از ورود به آن اجتناب کند(روش اجتناب مهاری)، تاخیرش در ورود به بخش تاریک، نسبت به آنچه که در روز آموزش مشاهده شده، به طور قابل توجهی افزایش می یابد و اصطلاحا حافظه ی بهتری دارد.
۳-۱۳- تیمار های دارویی و آزمایشهای انجام شده
۳-۱۳-۱- آزمایش شماره ۲: بررسی تاثیر تزریق پس از آموزش AM630 بر روی حافظه ی اجتنابی مهاری (نمودار Dose response)
گروه اول : گروه شم جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار (µl/rat 1) سالین را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه دوم: گروه شم جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار (۱ µl/rat) حامل(DMSO 10درصد) را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه سوم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار µl/rat) AM630(1 با غلظت۵۰ ng/µl را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه چهارم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدارµl/rat) 1)AM630 با غلظت ng/ µl 75 را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه پنجم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار AM630(1µl/rat)با غلظت ng/µl 100 را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه ششم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار ( AM630(1µl/rat)با غلظت ۱۲۵ng/µl را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
۳-۱۳-۲- آزمایش شماره ۳: بررسی تاثیر تزریق پس از آموزش GP1a بر روی حافظه ی اجتنابی مهاری (نمودار Dose response)
گروه اول : گروه شم جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار (µl/rat 1) سالین را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه دوم: گروه شم جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار (µl/rat 1) حامل(DMSO 20 درصد) را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه سوم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار (۱µl/rat GP1a(با غلظتµl 50 ng/را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه چهارم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار µl/rat) GP1a(1 با غلظت ng/µl 75را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه پنجم: : گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار (GP1a(1µl/rat با غلظت ۱۰۰ ng /µl را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه ششم: : گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار (GP1a(1µl/rat با غلظت /µl 125 ngرا به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند..
۳-۱۳-۳- آزمایش شماره ۳: بررسی تاثیر تزریق پس از آموزش D-AP5 بر روی حافظه ی اجتنابی مهاری (نمودار Dose response)
گروه اول : گروه شم جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار ( µl/rat 1) سالین(حامل) را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه دوم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار( (۱µl/rat D-AP5 با غلظت / ۰.۲۵µg/ µL را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.
گروه سوم: گروه تجربی جراحی شده و بلافاصله بعد از آموزش مقدار D-AP5(1µl/rat) با غلظت ۰.۰۵µg /µl را به صورت درون مغزی (Intra-CA1) دریافت می کنند.