نام سویه

 

 

 

۱۰۰%

 

Nocardia carnea ( BAFV01000017)

 

KF555378

 

UTMC 877

 

 

 

۹۸٫۷۸%

 

Streptomyces cacaoi subsp. cacaoi (AB184115)

 

KF555382

 

UTMC 638

 

 

 

۹۹٫۸۵%

 

Nocardia carnea (BAFV01000017)

 

KF555383

 

UTMC 863

 

 

 

۹۹٫۲۹%

 

Kribblla sancticallisti (AM778577)

 

KF555381

 

UTMC 919

 

 

 

۹۹٫۸۶%

 

Streptomyces aureoverticillatus (AY999774)

 

KF555380

 

UTMC 676

 

 

 

فصل پنجم:
بحث و
نتیجه‌گیری
علی رغم پیشرفت های اخیر در درمان بیماران مبتلا به سرطان و مراقب از آن ها، سرطان همچنان یک بیماری مهلک می باشد که در مقابل درمان ها از خود مقاومت نشان می دهد. در حال حاضر، اکثر بیماران مبتلا به سرطان، تا زمان مراحل پایانی اقسام متفاوت این بیماری، با شیمی درمانی معالجه می شوند. با این‌حال یکی از نقایص مهم شماری از فرایند­های شیمی درمانی، سمیت سیستمیک ناخواسته ی آن هاست، که ممکن است منجر به مرگ شوند. بنابراین، برای معالجه و مدیریت موثر سرطان، درمان های نوین مورد نیاز می باشد. درمان‌های نوین با سمیت سیستمیک محدود شده، تجویز آسان تر، سودمندی طولانی مدت تر و قابلیت همزیستی با داروهای مخصوص شیمی درمانی کنونی، را دارا باشد. علاوه بر این بقا و کیفیت زندگی بیماران را ارتقا بخشند و نیز دارای صرفه‌ی اقتصادی نیز باشند. بنابراین، داروهای نوین درمان شیمیایی سرطان، کاندید‌های مهمی برای بررسی به حساب می آیند (۴۴).

همچنین در سال‌های اخیر به علت مقاومت های دارویی سرطان‌ها به شیمی درمانی و شیوع این بیماری نیاز به داروهای جدید و شناسایی منبع آنها بیشتر احساس می‌شود.
طبق آخرین اطلاعات موجود که در سال ۲۰۰۸ توسط آژانس بین‌المللی پژوهش درباره سرطان^[۷۴] وابسته به سازمان سلامت جهانی^[۷۵] انجام گرفته است سرطان ریه پس از سرطان سینه و پروستات سومین سرطان رایج از نظر ابتلا و اولین سرطان از نظر مرگ ومیر در دنیا می‌باشد، همچنین این سرطان در کشورهای کمتر توسعه یافته و کشور‌های توسعه یافته به ترتیب رتبه دوم و سوم را از نظر ابتلا دارد ولی در هر دو گروه سرطان ریه رتبه اول را در زمینه مرگ و میر دارد (۳۱).
اکتینومیست‌ها یک منبع مهم در زمینه‌ی تولید ترکیبات ضد سرطان می باشند شناسایی وغربالگری این باکتری ها و عصاره های آنها امری مهم تلقی می شود. ترکیبات ضد سرطان با منشاء اکتینومیست تنوع گسترده‌ای از ساختارهای شیمیایی را شامل آنتراسیکلین‌ها، پپتید‌های کوچک، گلیکوپپتید‌ها و غیره را نشان می‌دهند. این ساختارهای شیمیایی متنوع صرفا” منعکس کننده تنوع واحد‌های سازنده اصلی نبوده بلکه نشان دهنده توانمندی‌های این میکروارگانیسم‌ها برای انجام مجموعه‌ای از واکنش‌های شیمیایی مانند متراکم شدن، متیله شدن، اکسید شدن، پلیمریزه شدن و احیا شدن هستند. از این رو باتوجه به پتانسیل بالای سنتز شیمیایی در این گروه از باکتری‌ها از اکتینومیست‌ها برای تولید ترکیبات ضد سرطان استفاده شد.
تقریبا در همه اکوسیستم‌ها صرف نظر از اینکه شرایط آن‌ها به چه میزان سخت است، گروهی از میکروارگانیسم‌ها می‌توانند رشد کنند. در این اکوسیستم‌های خاص یافتن مسیرهای متابولیکی خاص انتظار می‌رود که امکان سازگاری و بقاء میکروارگانیسم را فراهم می‌سازند. از این رو جمع‌ آوری میکروارگانیسم‌ها از اکوسیستم‌های متنوع با تامین مسیرهای متابولیکی متنوع ، منبعی غنی برای کشف متابولیت‌های ثانویه فراهم می‌سازد، که این شرایط به کمک مرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران^[۷۶] در این پژوهش، امکان پذیر شد. زیرا ۴۰ سویه‌ی اکتینومیست که در این پژوهش به کار برده شد از UTMC تامین شد و این باکتری‌ها از مناطق ایران با شریط خاص قبلا جداسازی شده بودند، که بررسی به روی آنها این امکان را فراهم می آورد که احتمالا ترکیبات جدیدی تر عصاره‌های پنج اکتینومیست منتخب این پژوهش وجود داشته باشد.
برای غربالگری اولیه از تست آرتمیا استفاده شد. این تست سریع و آسان و معتبر برای غربالگری ترکیبات سیتوتوکسیک می‌باشد، که هم برای عصاره‌های گیاهی وهم عصاره‌های باکتری به‌کار می‌رود. به عبارت دیگر با این آزمون تعداد زیادی از باکتری‌ها براحتی از لحاظ تولید ترکیب سیتوتوکسیک بررسی می شوند. آرتمیا به عنوان یک ابزار سنجش سمیت در انواع مختلف تست ها بکار می‌رود. در بین ابزارهای تشخیص سمیت این تست توانایی بررسی باقیمانده ی آفت کشها ، میکو توکسین ها ، آلاینده های قوی ، بیحس کننده‌ها، ترکیبات dinoflagellate، سمیت ناشی از نفت، استریول هایcocarcinogenicity و سموم های موجود در محیط دریایی، فلزات سنگین را دارد (۴۷)، (۴۵). همچنین آنالیز این تست برای اثر کشندگی ساده است چون دو حالت زنده ویا مرده بیشتر وجود ندارد (۳۵). آزمون زیستی آرتمیا به عنوان یک شاخص برای سمیت و همچنین به عنوان یک راهنما برای تشخیص ترکیبات ضد تومور مورد استفاده است (۲۴).
از نکات مهم انجام تست مربوط به مرحله Hatching لاروهای آرتمیا می‌باشد لاروها برای انجام این تست نباید بیشتر از ۴۸ ساعت از عمرشان گذشته باشد زیرا پس از گذشت ۴۸ ساعت آرتمیا از مرحله‌ی لاروی خارج شده که دیگر برای انجام تست اعتباری ندارد، همچنین برای انجام این تست نیاز به مقدار مناسبی از لارو آرتمیا می‌باشد. برای حل این مشکل سیستم ارلیفت طراحی شد تا با هوادهی مناسب تخم‌ها حجم مناسبی از لاروها در زمان مناسبی Hatch شوند.
در این تست به علت حساسیت نمونه آرتمیای تهیه شده زمان انجام تست از ۲۴ ساعت به ۱۸ ساعت کاهش یافت .
هشت سویه شامل سویه های UTMC 521، UTMC 1007، UTMC 1006، UTMC 528، UTMC 705، UTMC 709، UTMC 863، UTMC 925 دارای اثرات بالاتری نسبت به دیگر سویه‌های این جدول داشتند (اثر کشندگی بالای ۵۰٪) ولی پس از انجام آزمون سلولیMTT بر روی این ۲۳ سویه تنها یکی از این سویه‌ها (UTMC 863) در گروه پنج عصاره‌ی منتخب نهایی قرار داشت؛ پس می‌توان این نتیجه را گرفت که سرعت آزمون ارزیابی سمیت آرتمیا در برابر دقت آن برای غربالگری بیشتر است ولی با این وجود این تست به عنوان یک تست غربالگری اولیه تست قابل قبولی است.
مقایسه بین LC₅₀ حاصل از ۲۳ سویه عصاره که محدوده اثر ۵۹-۴۰% (اثر خوب) داشتند با پژوهش صفائیان و همکاران (۶) که در آن LC₅₀ بهترین جدایه که به طور نسبی خالص شده بود برابر mg/ml5/0اعلام شده که این مقدار در مقایسه با LC₅₀، ۲۳ سویه منتخب غربالگری اولیه بسیار بالاتر است و باید به این نکته توجه شود که در پژوهش صفائیان و همکاران عصاره به صورت نسبی تخلیص شده بود ولی در این پژوهش عصاره‌ها به صورت تخلیص نشده برای تست آرتمیا بکار برده شد ولی با این وجود LC₅₀ عصاره‌های این سویه‌ها در این مرحله تست غربالگری بسیار پائین تر از پژوهش صفائیان و همکاران بوده است.
انتخاب دودمان سلولی برای انجام تست ارزیابی سمیت سلولی باتوجه به شیوع سرطان ریه (سرطان سلول‌های غیر کوچک وسرطان سلول‌های کوچک) انجام گرفت. شیوع سرطان سلول‌های غیر کوچک در بین دو نوع سرطان ریه بیشتر است، در حدود ۷۵-۸۰% سرطان ریه به این گروه از سرطان‌ها تعلق دارد و نیز از بین دودمان‌های سرطان سلول‌های غیر کوچک براساس تکرار در مقالات از دودمان سلولیA549 استفاده شد.
همان گونه که گفته شد ۲۳ سویه با اثر سیتوتوکسیک در تست آرتمیا غربالگری شدند، برای غربالگری بیشتر و دقیق تر سویه‌ها و انتخاب غلظت مناسب برای انجام تست ارزیابی به این نکته توجه شد که اگر عصاره‌ای بتواند در کمترین غلظت اثر سیتوتوکسیک خود را اعمال کند پس در نتیجه عصاره‌ی موثرتری خواهد بود از پایین‌ترین غلظت استفاده شده در تست آرتمیا (µg/ml 5) در تست سلولی نیز استفاده شد.
در بررسی اثر عصاره ها به روی دودمان سلولی A549 از DMSO نیز به تنهایی برای تیمار سلول‌ها استفاده شد تا از اثر ایجاد شده به روی سلول توسط عصاره اطمینان حاصل شود. با مقایسه مقدار جذب بین DMSO و شاهد (پیوست ۴-۴) می‌توان این نتیجه را گرفت که اثر کشندگی ایجاد شده مربوط به عصاره‌های حل شده در DMSO می‌باشد. همچنین نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی سلول‌ها تائیدی برای نتایج تست MTT می‌باشد. در بررسی‌های ریخت شناسی (جدول ‏۴‑۵ وشکل ۴-۱) اثرات آسیب‌‌دیدگی سلولی از جمله عدم پاره شدگی غشاء در زیر میکروسکوپ ونیز جمع شدگی در سلول‌ها دیده شد که این می تواند دلیلی بر اثر آپوپتوزی بودن این عصاره‌ی این سلول‌ها باشد (۲۷) و برای اثبات این فرایند انجام آزمایش‌هایی مانند فلوسیتومتری و یا DAPI به عنوان آزمایش‌های تشخیص نکروز از آپوپتوز پیشنهاد می‌شود که انجام شود (۳۰).
پس از انجام بررسی داده‌های حاصل از تست MTT به کمک نرم افزار SPSS شش سویه براساس تحلیل p value داده‌ها انتخاب شدند در ادامه نمودار میانگین جذب این شش سویه با کنترل (نمودار ۴-۱) رسم شد. با بررسی نمودار مشخص شد که از بین این شش سویه تنها پنج سویه اثرات کشندگی و سیتوتوکسی دارند و یک سویه با وجود ۰۵/۰≥p ولی در مقایسه میانگین جذب این سویه‌ها با شاهد (سلول به همراه محیط کشت سلولی) مشخص شد که این سویه باعث افزایش رشد شده است، بنابراین براساس هدف این پژوهش که بررسی وشناسایی اکتینومیست‌های تولید کننده‌ی ترکیبات ضد سرطان بود ادامه فعالیت‌های تکمیلی که مربوط به شناسایی سویه‌های منتخب بود به روی پنج سویه‌ای که اثر کشندگی داشتند انجام شد.