۲۰ تا ۳۰ دقیقه محلول را روی یخ انکوبه می کنیم.
سپس محلول را به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
رسوب را در ۳۰۰ میکرولیتر محلول کلرید کلسیم استریل حل می کنیم.
به مدت ۲۰ دقیقه محلول را بر روی یخ قرار می دهیم.
این باکتری ها تا ۷۲ ساعت روی یخ رد یخچال قابل نگهداری می باشند و می توان با افزودن گلیرول استریل ۳۰ درصد آنها را در ۷۰- درجه سانتیگراد به مدت چند ماه نگهداری کرد.
۳-۵-۳-۲ ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن به روش شوک حرارتی
مراحل انجام کار به صورت زیر است :
ابتدا ۱۰۰ میکرولیتر از سلول های مستعد E.coli BL21(DE3) را روی یخ ذوب می کنیم.
۳۰ میکرولیتر از محصول لایگیشن را به ۱۰۰ میکرولیتر از سلول های مستعد اضافه می کنیم به طوری که کاملا با هم مخلوط شوند.
این مخلوط را به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ انکوبه می کنیم.
نمونه ها را به مدت ۹۰ ثانیه در بن ماری ۴۲ درجه سانتیگراد قرار می دهیم و بلافاصله به روی یخ منتقل می کنیم و ۵ دقیقه اجازه می دهیم بدون حرکت روی یخ بماند.
مخلوط فوق را به ۹۰۰ میکرولیتر از محیط LB فاقد کانامایسین افزوده و آن را به مدت ۵/۱ ساعت در شیکرانکوباتور ۳۷ درجه قرار می دهیم تا باکتری های ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثیر نمایند.
مخلوط فوق را به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
۸۰۰ میکرولیتر از مایع روئی را دور ریخته و رسوب را در ۲۳۰ میکرولیتر باقی مانده ، به خوبی حل می کنیم.
۲۳۰ میکرولیتر را روی یک پلیت حاوی LB آگار کانامایسین دار ریخته و کشت سه قسمتی می دهیم ، اجازه می دهیم کاملا جذب محیط شده و سپس آنها را به مدت ۱۸ تا ۲۰ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه نگهداری می کنیم.
۳-۵-۴ ارزیابی کلونی ها
پس از انکوباسیون در ۳۷ درجه سانتیگراد اندازه کلونی ها به حدود ۱ تا ۲ میلی متر می رسد. یک تک کلونی را جدا کرده و در ۵ میلی متر LB براث کانامایسین دار تلقیح می نمائیم و به مدت یک شب در ۳۷ درجه و با سرعت مناسب شیکر انکوبه می نمائیم. با رشد باکتری در این محیط تایید می شود که باکتری BL21(DE3) پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن ما را دریافت کرده است.
۳-۵-۵ استخراج پلاسمید بیانی pet-28a حاوی ژن CD166
جهت تایید وجود پلاسمید بیانی pet-28a در باکتری و عدم وجود هر گونه آلودگی در محیط کشت نیاز است که وجود پلاسمید موردنظر تایید شود ، بدین منظور از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسمید صورت گرفت. مراحل انجام کار به صورت زیر است :
از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده که به مدت یک شبانه روز در دمای ۳۷ درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، ۵/۱ میلی لیتر جدا کرده و داخل میکروتیوب ۵/۱ می ریزیم.
سپس به مدت ۳ دقیقه در ۹۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
محیط روئی را دور ریخته و باکتری در ته میکروتیوب رسوب می کند.
نکته : برای استخراج غلظت بالاتری از پلاسمید می توان مراحل قبل را تکرار کرد.

در این مرحله ۲۵۰ میکرولیتر از بافر محلول کننده که دارای RNAase است به رسوب باکتری اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم می زنیم تا رسوبی در ته میکروتیوب باقی نماند و تمامی آن در حلال حل شود.
۲۵۰ میکرولیتر از محلول لیز کننده به مخلوط اضافه می کنیم سپس آن را ۴ تا ۶ بار سروته می کنیم تا کاملا مخلوط شود. این بافر کاملا باکتری را لیز می کند.
در مرحله ی بعد ۳۵۰ میکرولیتر از بافر خنثی کننده به مخلوط مرحله قبل اضافه می کنیم. سپس سریعا میکروتیوب را چند بار سروته می کنیم تا باکتری های لیز شده به حالت ابری شکل لخته شوند.
سپس به مدت ۵ دقیقه در ۹۰۰۰ دور محلول را سانتریفیوژ کرده تا قطعات باکتری رسوب کنند.
محلول روئی را نگه داشته و رسوب را دور می ریزیم.
محلول روئی به ستون استخراج پلاسمید منتقل می کنیم. این ستون حاوی سیلیکا است که پلاسمید را جذب می کند.
ستون حاوی محلول را به مدت ۱ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم.
محلول روئی را دور می ریزیم.
به ستون ۵۰۰ میکرولیتر بافر شستشو اضافه می کنیم.
به مدت ۴۵ ثانیه در ۱۲۰۰۰ دور ستون را سانتریفیوژ می کنیم.
مرحله قبل را یکبار دیگر تکرار می کنیم.
محلول درون ستون را دور می ریزیم.
ستون را به مدت ۱ دقیقه دیگر در ۱۲۰۰۰ دور سانتریفیوژ می کنیم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ی قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زیر الکل مانع واکنش های آنزیمی می باشد.
ستون را درون یک میکروتیوب ۵/۱ قرار می دهیم و سپس بافر جداکننده را به میزان ۵۰ میکرولیتر به ستون اضافه می کنیم. بافر جدا کننده دقیقا باید بر روی سیلیکا ریخته شود. ۲ الی ۳ دقیقه در دمای اتاق ستون را نگه می داریم تا بافر کاملا به سیلیکا نفوذ کند.
به مدت ۲ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور ستون را در درون میکروتیوب ۵/۱ سانتریفیوژ می کنیم.
ستون را دور ریخته و محلول درون میکروتیوب حاوی پلاسمید استخراج شده است.
۳-۵-۶ تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده
بعد از استخراج پلاسمید pet-28a که حاوی ژن CD166 انتقال داده شده به آن به کمک تکنیک لایگیشن است و تایید وجود آن ، با توجه به جایگاههای آنزیمی در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهای ژن CD166 می توان از آنها جهت تایید حضور ژن در پلاسمید استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزیمی دوگانه جهت بررسی بر روی ژل آگارز بوده تا قطعات موردنظر مربوط به پلاسمید و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
۳-۵-۶-۱ هضم آنزیمی دوگانه و الکتروفورز
مراحل انجام کار به شکل زیر است :
یک میکروتیوب ۲/۰ برمی داریم و محتویات واکنش را به صورت زیر در آن مخلوط می کنیم.
آب استریل : ۱۲ میکرولیتر