<p>۲-۱۱- ارزیابی کیفیت کروماتین/DNA اسپرم توسط رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB)<br />پروتئین هیستون دارای تعداد زیادی اسید آمینه لیزین می باشد که با رنگ های اسیدی همانند AB واکنش می دهد و آبی رنگ می شود. بنابراین اسپرم هایی که پس از ایجاد تراکم در کروماتین خود دارای هیستون اضافی می باشند با این رنگ آمیزی مشخص می شوند.( Erenpreiss et al, 2001).برای انجام این تست پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک شدن در هوا،توسط فیکساتیو گلوتارآلدهید ۳% به مدت ۳۰ دقیقه عمل ثابت شدن صورت پذیرد. در مرحله بعد نمونه ها توسط محلول ۵% آنیلین بلو در اسید استیک ۴% به مدت ۵-۸ دقیقه رنگ آمیزی شدند. سپس لامها را با میکروسکوپ نوری مورد بررسی قرار گرفتندو با شمارش پنج اسلاید برای هر رت و صد عدد اسپرم در هر اسلاید، تعداد اسپرم های با سر بی رنگ (بالغ) و سر آبی رنگ (نابالغ) در هر نمونه تعیین گردید. ( Nasr- Esfahani et al, 2001)<br /><a href="https://nefo.ir/"><img class="alignnone wp-image-67″ src="https://ziso.ir/wp-content/uploads/2021/10/THESIS-PAPER-1.png” alt="پایان نامه” width="344″ height="91″ /></a><br />۲-۱۲- بررسی میزان آسیب DNA اسپرم<br /><strong>رنگ آمیزی آکریدین اورنج</strong><strong>(AO)</strong><br /&

شکل پیوست د ۱: درخت تصمیم اولیه
حال برای شاخه­ های low و medium ویژگی غالب را انتخاب نماییم. مشابه روند فوق برای محاسبه ریشه، بهره را برای ویژگی­های باقیمانده و برای هر شاخه بطور جداگانه محاسبه خواهیم کرد.

ب-۱- بهره اطلاعاتی Memory برای شاخه low

ب-۲- بهره اطلاعاتیPrice برای شاخه low

با توجه به بزرگتر بودن بهره اطلاعاتی ویژگی Memory، این ویژگی به عنوان فرزند شاخه low انتخاب می­گردد. با توجه به اینکه بهره اطلاعاتی برای زیرمجموعه Memory با آنتروپی شاخه low برابر شده، در نتیجه دو زیرمجموعه >4 , <=4 خود به عنوان کلاس انتخاب می­شوند. این نتیجه را می­توان در شکل پیوست د ۲ مشاهده نمود.

شکل پیوست د ۲: درخت در مرحله دوم
ج-۱- بهره اطلاعاتی Memory برای شاخه medium

ج-۱- بهره اطلاعاتی Memory برای شاخه medium

مانند بخش ب، بهره اطلاعاتی برای ویژگی Price بزرگتر بوده و به عنوان فرزند شاخه medium انتخاب خواهد شد. به دلیل اینکه بهره اطلاعاتی این ویژگی با آنتروپی شاخه برابر شده در نتیجه دو زیر مجموعه ویژگی Price به عنوان کلاس انتخاب می­شوند.
به دلیل اینکه آنتروپی دو شاخه low و medium با بهره اطلاعاتی دو ویژگی برابر شده، در نتیجه آنتروپی در مراحل بعد صفر خواهد شد و این به عنای اتمام کار طبقه ­بندی است، زیرا تا آنجا پیش خواهیم رفت که آنتروپی به صفر برسد. شکل پیوست د ۳ درخت نهایی را نشان می­دهد.

شکل پیوست د ۳: درخت نهایی
با نوشتن فایل مربوط به این مثال در نرم­افزار وکا، درخت ایجاد شده در آن دقیقا مشابه درخت فوق خواهد شد و درصد دقت آن برابر ۱۰۰ می­باشد.

پیوست ی- مشخصات فنی ترانسفورماتور

ترانسفورماتور سه فاز دوسیم­پیچه با اتصال ستاره- ستاره بیست مگاولت-آمپر با نشخصات زیر استفاده شده است:
سیم­پیچ فشارقوی ۸۲ دیسک و ۵۶۴ دور با ابعاد هادی  و شعاع داخلی و خارجی ۶۴۶ و ۷۴۷ میلیمتر و ارتفاع آن ۱۵۷۶ میلیمتر و ضخامت عایق کاغذ۵/۰ میلیمترمی­باشد.
سیم­پیچ فشارضعیف از نوع مارپیچی و دارای ۶۹ دور با ابعاد هادی  و شعاع داخلی و خارجی ۴۸۳ و ۵۷۶ میلیمتر و ارتفاع آن ۱۵۷۶ میلیمتر و ضخامت عایق کاغذ۳/۰ میلیمترمی­باشد.
هسته بصورت ۱۳ پله و مساحت متوسط  در ستون و  در یوغ­ها و شعاع ستون­ها mm450 و شعاع یوغ­­ها mm480 و ارتفاع پنجره هسته ۱۷۵۰ و ارتفاع کل هسته ۲۷۱۰ میلیمتر می­باشد. فاصله بین دو ساق مجاور هم ۹۰۰ میلیمتر است.
ابعاد تانک هم برابر  می­باشد.
مراجع

gt;این رنگ فلوروسنت جهت تمایز DNA دو رشته ای سالم از DNA تک رشته ای دناتوره شده به کار می رود. AO با DNA سالم زیر میکروسکوپ فلوروسنت سبز رنگ و با DNA تک رشته ای دناتوره زرد تا قرمز رنگ می شود.پس از تهیه اسمیر و خشک نمودن در هوا فیکساسیون اسمیرها توسط محلول کارنوی (متانول-اسید استیک با نسبت۳:۱) به مدت حداقل دو ساعت انجام گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت mg19/0 در بافر سیترات فسفات به مدت ۱۰ دقیقه بر روی لام ریخته شد. پس از شستشوی لامها توسط آب جاری وقرار دادن لامل بر روی آنها، توسط میکروسکوپ فلوروسنت با فیلتر nm460 بررسی شد(.(Erenpreiss et al ,2001<br />۲-۱۳ آزمایشات بیوشیمیایی سرم<br />اندازه گیری میزان سرمی تستوسترون<br />نمونه های خون رتهای گروه های مختلف آزمایشی در روزهای ۱۵و ۳۰ و ۴۵ مستقیماً از قلب این حیوانات گرفته شد و پس از سانتریفیوژ نمونه ها در ۳۰۰۰ دور به مدت ۵ دقیقه سرم جدا شد و در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد تا زمان انجام آنالیز هورمونی نگهداری شد. برای اندازه گیری تستوسترون با روش الایزا (ELISA)^[65]&nbsp;با بهره گرفتن از کیت با مشخصه (Demeditec Diagnostics GmbH, Kiel, Germany) انجام شد.<br />۲-۱۴-آزمایش بیوشیمیایی بافت بیضه<br />۲-۱۴-۱-اندازه گیری میزان مالون دی-آلدئید (MDA)^[66]&nbsp;بافت بیضه<br />طرز تهیه بافر :<br />محلول ۱ :<br />۵۰۴۰/۱ گرم از NaH₂PO₄&nbsp;را وزن نموده و ۱۷۹۰/۲ گرم از Na₂HPO_4&nbsp;را برداشته در بالن ۱۰۰ ریخته به حجم می رسانیم PH را روی ۴/۷ تنظیم می کنیم .<br />محلول ۲ :<br />۱۰ گرم TCA را در یک بالن ۱۰۰ با آب مقطر به حجم میرسانیم .<br />محلول ۳ :<br />۶۷/۰ گرم از TBA را در بالن ۱۰۰ ریخته و به حجم میرسانیم .<br />نمونه را وزن نموده و ۱۰% وزنی حجمی در آن بافر فسفات می ریزیم در هاون کوبیده ودر مدت ۵ دقیقه در دور ۱۰۰۰ سانتریفوژ کرده سپس ۱۵۰ مایکرولیتر از نمونه رویی را برداشته در میکروتیوپ می ریزیم و ۳۰۰ مایکرولیتر TCA 10% به آن اضافه نموده و به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۱۰۰۰ در دمای ۴ درجه سانتریفوژ کردیم .<br />۳۰۰ مایکرولیتر از محلول رویی را به لوله آزمایش منتقل نموده و با ۳۰۰ مایکرولیتر از TBA 67% در دمای ۱۰۰ سانتی گراد برای مدت ۲۵ دقیقه آنکوبه نمودیم .<br />۵ دقیقه بعد از خنک شدن محلول رنگی صورتی ناشی از واکنش MDA-TBA ظاهر و به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۳۵ نانومتر ارزیابی نمودیم . (Hosseinzadehand sadeghnia,2005).<br />۲-۱۴-۲-سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز:<br />.برای این منظور از پراکسیدهیدروژن ۳۰ میلی مولار به عنوان سوبسترا و از بافرفسفات ۵۰ میلی مولار با (PH=7) به عنوان جایگزین سوبسترا در محلول بلانک استفاده شد .محلول سنجش محتوی ۲ میلی لیتر محلول هموژنای بافتی و ۱ میلی لیتر محلول پراکسیدهیدروژن بود .واکنش با افزودن H2O2 شروع شده و کاهش در جذب به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج ۲۴۰ نانومتر به مدت ۳۰ ثانیه بررسی گردیده و در پایان مقادیر بر حسب tissue U/gr بیان گردید. ( Aebi ,1984)..<br />۲-۱۴-۳-اندازه گیری میزان ظرفیت آنتی اکسیدانی تام^[۶۷](TAOC) در بافت بیضه :<br />آنتی اکسیدانت ها ،مولکول هایی هستند که قادرند تا اکسیداسیون دیگر مولکول ها را کند کرده و یا از آن جلوگیری کنند .آنتی اکسیدانت ها می توانند واسطه های رادیکال آزاد را حذف کرده و واکنش پذیری اکسیدانت های دیگر را توسط اکسید شدن خودشان ، مهار کنند.یک تست ساده و به صورت خودکار اندازه گیری و ارزیابی آنتی اکسیدانت ، تست ferric reducing antioxidant power می باشد .کاهش یون فریک به فروس در PH پایین باعث تشکیل یک کمپلکس رنگی ferrous –tripyridytrizine می شود . ارزش و مقدار FRAP توسط مقایسه کردن تغییر جذب در ۵۹۳ nm در مخلوط واکنشی تست با مخلوط شامل یون فروس با غلظت مشخص به دست می آید . به طور بالقوه ROS مضر به عنوان یک نتیجه متابولیسم هوازی نرمال تولید می شود .این رادیکال های آزاد معمولا در invivo توسط گروهی از آنتی اکسیدانت ها حذف و یا غیر فعال می شوند .در PH پایین ، هنگامی که کمپلکس Fe^Ш-TPTZ به فرم فروس (Fe^п) کاهش می یابد ، یک رنگ آبی شدید با یک جذب بالا در ۵۹۳nm ایجاد می کند .شرایط برای کاهش مطلوب کمپلکس و بنابراین توسعه و پیشرفت رنگ ،فراهم می شود در صورتیکه ردوکتانت (آنتی اکسیدانت )حضور داشته باشند(Iris and strain ,1996).<br />محلول استاندارد Fe^п&nbsp;۱۰۰ به ۲۰۰۰ میلی مول از فروس سولفات Feso4.7H2o2 در آب مقطر آماده می شود .داده ها بر اساس میلی مول وزن بافت بیان می شود (FRAP value) (Hosseinzadeh and sadeghnia ,2005;&nbsp;Hosseinzadeh and sadeghnia ,2005a ; Iris and strain ,1996 ).<br />۲-۱۵-بررسی بافت بیضه<br />روش تهیه مقاطع بافتی بیضه<br />در این مرحله از کار نمونه های بافتی به مدت ۷۲-۴۸ ساعت در محلول ثبوتی فرمالین – سرم فیزیولوژی قرار داده شدند فرمول محلول ثبوتی فرمالین – سرم فیزیولوژی به قرار زیر است<br />آلدئید فرمیک تجاری: ۱۰۰ میلی لیتر<br />کلرور سدیم : ۹ گرم<br />آب مقطر : ۹۰۰ میلی لیتر<br />پس از تثبیت نمونه ها مراحل مختلف طی گردید که عبارتند از<br />آبگیری<br />بافت تثبیت شده مقدار زیادی آب دارد که می توان موجب اختلال در انجام مراحل تهیه مقطع شود آب موجود در بافت در طی مرحله آبگیری گرفته می شود در این مرحله نمونه ها با بهره گرفتن از الکل اتیلیک آبگیری می شوند بدین منظور از الکل اتیلیک با غلظتهای صعودی استفاده می شود که به ترتیب شامل الکل ۷۰و ۸۰و ۹۰ و دو ظرف الکل مطلق می باشند مدت زمان لازم برای قرار دادن نمونه ها در هر ظرف در داخل انکوباتور حدود ۱ ساعت است<br />شفاف سازی<br />الکل اتیلیک قابلیت اختلاط با پارافین مذاب را ندارد بنابراین بافت آبگیری شده قبل از مرحله آغشتگی در ظرف محتوای گزیلول به مدت ۳۰ دقیقه (در داخل انکوباتور) و در ظرف محتوای روغن سدر از شب تا صبح (در خارج از انکوباتور) قرار داده شد .<br />آغشتگی با پارافین<br />قبل از قرار گرفتن در پارافین نمونه ها به مدت ۳۰ دقیقه در گزیلول (در داخل انکوباتور) قرار داده شدند و پس از آن در ۳ ظرف حاوی پارافین مذاب ۵۶-۵۵ درجه سانتی گراد(در داخل انکوباتور) قرار گرفتند پس از ۴ ساعت نمونه ها از پارافین خارج شدند<br />مجموعه این سه مرحله پاساژ بافت نامیده می شود<br />قالب گیری<br />پس از طی مراحل پاساژ بافت نمونه ها با بهره گرفتن از پارافین مذاب قالب گیری شدند نمونه بافتی از سطحی که برای برش در نظر گرفته شده بود در قالب قرار داده شده و سپس پارافین مذاب درون قالب ریخته شد پس از سرد شدن پارافین و منجمد شدن آن قالب ها جدا شدند.<br />برش بافتی<br />بعد از مرحله قالب گیری و جدا کردن قالب ها اقدام به برش بافتی گردید بدین منظور با بهره گرفتن از دستگاه میکروتوم برش هایی با ضخامت ۶ میکرون تهیه شده و در بن ماری ۵۰ درجه سانتی گراد قرار داده شدند سپس با بهره گرفتن از لام های آغشته به چسب آلبومین، نمونه های مورد نظر از سطح آب برداشته شدند لام ها حداقل به مدت ۲۴ ساعت در هوای آزمایشگاه باقی ماندند تا کاملا خشک شوند بدین ترتیب نمونه های بافتی برای انجام رنگ آمیزی و مطالعات بافتی آماده شدند.<br />۲-۱۶ رنگ آمیزی<br />برای رنگ آمیزی برش های بافتی از رنگ های هماتوکسیلین، ائوزین وآهن وایگرت استفاده شد.<br />۲-۱۶-۱ رنگ آمیزی هماتوکسیلین ائوزین<br />هماتوکسیلین و ائوزین به ترتیب برای رنگ آمیزی هسته و سیتوپلاسم به کار می روند مواد لازم در این رنگ آمیزی عبارتند از<br />گزیلول<br />الکل اتیلیک با غلظت های ۷۰ درصد تا مطلق<br />اسید الکل</p>