در حال حاضر پذیرفته شده است که افزایش التهاب یکی از فاکتورهای اصلی در توسعه مقاومت انسولینی میباشد. زمانی که گیرنده های الگوشناسی غشایی^[۱۳] یا (TLR) توسط لیپوپلی ساکاریدهای غشاهای باکتریایی فعال می‌گردند فاکتور هسته‌ای را برای تولید سیتوکین‌ها فعال می‌نمایند. اسیدهای چرب اشباع باعث تحریک و اسیدهای چرب غیر اشباع امگا-۳ موجب غیر فعال شدن TLR‌ها می‌گردند و التهاب را کاهش میدهند. این مکانیسم در کنار دیگر مکانیسمهای ضد التهابی اسیدهای چرب امگا-۳ میتواند از مقاومت انسولینی ممانعت نمایند [۱۵۲]. سطح پلاسمایی برخی از هورمون‌ها (آدیپونکتین، لپتین، رسیستین و ویسفاتین) و ادیپوسیتوکینها که توسط بافت چربی تولید میگردند نیز در توسعه مقاومت انسولینی نقش دارند. برخی از تحقیقات نشان دادند که لپتین و آدیپونکتین که اثرات حساس کننده انسولین دارند، تحت تأثیر تغذیه اسیدهای چرب امگا-۳ قرار می‌گیرد و غلظت و یا بیان ژن‌های موثر در تولید این هورمونها افزایش مییابد [۹۰]. اسیدهای چرب امگا-۳ فعالیت و بیان تعدادی از فاکتورهای رونویسی مربوط به متابولیسم چربی و گلوکز را تحت تأثیر قرار میدهند که توسط جامپ و همکاران [۱۲۹] نشان داده شد و خلاصه آن در شکل ۲-۴ نشان داده شده است.

علاوه بر مکانیسم‌های ذکر شده، اسیدهای چرب امگا-۳ مقاومت انسولین را از مسیرهای دیگر همچون کاهش تریگلیسیریدهای خون، لیپوپروتئینهای کم چگال، افزایش سیالیت غشا، انتقال تسهیل یافته سیگنالها و دیگر موارد بهبود می‌بخشند. سیالیت غشا نقش مهمی در ترشح و فعالیتهای بیولوژیک انسولین و جابجایی ناقلین گلوکز بازی مینماید[۱۶۱].
تحقیقات گذشته نشان دادند برخی از اسیدهای چرب توانایی تعدیل متابولیسم انرژی در شرایط آزمایشگاهی [۱۶۸] و درون تنی [۱۶۷] را دارند. تزریق سیاهرگی روغن کتان امولسیون شده به گاوهای شیری هلشتاین غیر شیرده غلظت بتاهیدروکسی بوتیرات و اسیدهای چرب غیراستریفیه را کاهش داده و تجمع تریگلیسیرید کبدی را نسبت به دام‌هایی که امولسیون پیه دریافت نمودند کاهش داد. با توجه به اینکه تفاوتی بین تیمارها بر اکسیداسیون اسیدهای چرب در کبد وجود نداشت، گمان میرود که اسید لینولنیک حساسیت بافت چربی به انسولین را افزایش داده و متابولیسم بافت چربی و لیپولیز کاهش یافته است [۱۶۷]. مقاومت انسولینی در دوره انتقال گاوهای شیری برای فرآهم نمودن مواد مغذی از قبیل گلوکز، اسیدهای آمینه و اسیدهای چرب به غدد پستانی ایجاد میگردد [۲۵]. افزایش سطح اسیدهای چرب غیراستریفیه در حول و حوش زایش اتفاقی معمول بوده و با کاهش مصرف خوراک و وقوع ناهنجاریهای متابولیکی مرتبط با متابولیسم انرژی همراه است [۱۰۵]. تحقیقات نشان دادند که افزایش سطح چربی خون با تزریق امولسیون پیه منجر به مقاومت انسولین شد و ترکیبات ضد لیپولیز مانند اسید نیکوتینیک پاسخ بافت چربی و کل بدن به انسولین را بیشتر نموده و نتیجه گیری شده است که سطح بالای اسیدهای چرب غیراستریفیه خون در حول و حوش زایش از فاکتورهای اصلی در بروز مقاومت انسولینی میباشد [۲۱۵]. تحقیقی که در این زمینه صورت گرفته است نشان داد که تزریق روغن کتان در مقایسه با تزریق پیه حساسیت انسولین را در گاوهای خشک نژاد هلشتاین افزایش داد و و اثرات ضد لیپولیزی انسولین را تقویت نمود [۲۱۴]. درگوسفند، حساسیت بافت چربی به اثرات ضد لیپولیزی انسولین نسبت به کل بدن بیشتر میباشد و به عبارت دیگر بافت چربی سریعتر از بیشتر بافت‌های بدن به انسولین پاسخ میدهد [۲۰۶ و ۲۰۷]، بنابراین انتظار میرود استراتژی هایی که موجب افزایش حساسیت بدن به انسولین در حول زایش میگردد در وحله اول بر بافت چربی اثر گذارد و منجر به کاهش نرخ لیپولیز و غلظت اسیدهای چرب غیراستریفیه خون گردد، در حالی که ممکن است بافت‌های دیگر در پاسخ به انسولین مقاومت نمایند [۲۱۴].
در تحقیقی دیگر مشاهده گردید که افزایش سطح اسیدهای چرب غیراستریفیه به دنبال تزریق شیردانی منابع مختلف چربی نرخ ناپدید شدن گلوکز خون را مختل و ترشح انسولین را کاهش داد که نشان دهنده کاهش حساسیت کل بدن به انسولین و اختلال بدن در پاسخ به سطوح بالای گلوکز در اواخر آبستنی میباشد. همچنین نشان داده شد که تزریق شیردانی روغن کاملینا که یک منبع اسیدهای چرب امگا-۳ می‌باشد، در مقایسه با پیه، حساسیت انسولین را بیشتر نمود و پیشنهاد گردید که احتمالا فعالیت سلولهای بتای پانکراس در دام‌های دریافت کننده روغن کاملینا کارامدتر عمل نموده و بخشی از مقاومت انسولینی ایجاد شده را جبران نمودند [۲۳۵]. اخیراً نشان داده شد که در گاوهای گوشتی در حال رشد، مکمل نمودن روغن ماهی کلسیمی شده که حاوی سطح بالایی از اسیدهای چرب امگا-۳ بود نسبت به زمانی که جیره حاوی مقادیر بالاتری از اسیدهای چرب اشباع بود، پاسخ بافت‌های مختلف را به انسولین بیشتر نموده و نتیجه گیری شد که پاسخ مشاهده شده در این تحقیق با نتایج به دست آمده از مدل‌های انسانی و دامی مشابهت دارد [۶۳].
تأثیر اسیدهای چرب ضروری بر وضعیت آنتی اکسیدانی
به منظور بهبود کیفیت تغذیه ای محصولات لبنی و گوشتی برای مصرف کنندگان و با تکیه بر اثرات سلامتی که اسیدهای چرب ضروری خصوصاً اسیدهای چرب امگا-۳ بر دام میتواند داشته باشد، مکمل نمودن این منابع از اسیدهای چرب یک استراتژی تغذیه‌ای ساده و موثر می‌باشد [۱۶ و ۷۱]. به هر حال، اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه اهداف ترجیهی به حمله رادیکال‌های آزاد می‌باشند که باعث آغاز پروکسیداسیون و القای تنش اکسیداتیو می‌گردند. در تحقیقات اولیه نشان داده شد که استفاده از اسیدهای چرب غیر اشباع موجود در روغن سویا که غنی از اسید لینولئیک می باشد نسبت به روغن زیتون که غنی از اسید اولئیک میباشد، شاخص‌های مختلف پروکسیداسیون را در مدل‌های تک معده‌ای افزایش می‌دهد [۲۴۰]. در تحقیقی مشاهده گردید که تزریق دئودنومی روغن آفتابگردان یا کتان به گوسالههای پرواری منجر به افزایش پروکسیداسیون اسیدهای چرب لیپوپروتئینها گردید و همچنین در بین دام‌هایی که دانه‌های روغنی کامل دریافت کردند، مقدار مالون‌دی آلدهید پلاسمای دام‌هایی که دانه کتان دریافت کرده بودند و شاخص پروکسیداسیون جیره بالاتری داشتند، افزایش یافت در حالی که دام‌های مصرف کننده دانه آفتابگردان که غنی از اسیدهای چرب امگا-۶ بود مقدار مالون‌دی آلدهید افزایشی نشان نداد [۲۴۵]. این نتایج مطابق با نتایج قبلی بود که در آن نشان داده شد قابلیت پروکسیداسیون اسیدهای چرب امگا-۳ دو برابر شدیدتر از اسید لینولئیک می‌باشد [۷۶]. سان و همکارن [۲۶۰] گزارش نمودند تزریق شیردانی اسید لینولنیک مقدار مالون‌دیآلدهید را بیشتر نمود و گوبرت و همکاران [۱۰۲] نیز گزارش نمودند تغذیه ۹/۱۷ درصد کتان اکسترود شده که ۵ درصد چربی به جیره اضافه نمود توانست پروکسیداسیون را به شدت افزایش داده و دام را در معرض تنش اکسیداتیو قرار دهد. با توجه به این که تنش اکسیداتیو زمینه ساز بسیاری از بیماریها و ناهنجاریها در نظر گرفته میشود[۳۵]، به نظر میرسد عدم تامین مقدار کافی منابع آنتی اکسیدانی در جیره ممکن است منجر به مشاهده برخی اثرات منفی به دنبال تغذیه اسیدهای چرب ضروری خصوصاً امگا-۳ گردد.
فصل سوم
مواد و روش‌ها
۳-۱- مواد و روش های مربوط به آزمایش اول
۳-۱-۱- مواد شیمیایی و محلولها
ماده ۲و۲-دی فنیل ۱-۱-پیکریل هیدرازیل (DPPH) از شرکت سیگما^[۱۴] خریداری شد. تیوباربیتوریک اسید، محلول ﻓﻮﻟﯿﻦ ﺳﯿﻮ ﮐﺎﻟﺘﯿﻮ، پتاسیم فروسیاناید، تری کلرو استیک اسید، کلرید آهن (۳)، کلرید آهن (۲)، فسفات سدیم، مولیبدات آمونیوم، کربنات سدیم و اسید سولفوریک از شرکت مرک^[۱۵] خریداری شد. پوست ساقه دارچین(Cinnamomum zeylanicum)، ریزوم زردچوبه (Curcuma longa)، برگ رزماری (Rosemarinus offıcinalis) و جوانه میخک (E. caryophyllata Tunb.) از بازار اصفهان خریداری شد.
۳-۱-۲-عصاره گیری از گیاهان دارویی
مواد گیاهی پس از خشک شدن پودر شد و عصارهگیری طبق روش احمدی و همکاران [۷] با کمی تغییرات صورت گرفت. بطور خلاصه، ۴ گرم از گیاهان پودر شده به داخل شیشههای قهوهای ریخته شد و ۸۰ میلی لیتر از محلول عصاره‌گیری (۸۰ درصد متانول، ۵/۱۹ درصد آب مقطر ۵/۰ درصد اسید استیک) به آن اضافه شد و به طور دستی مخلوط شد. سپس ویالها به مدت ۴۵ دقیقه در معرض امواج دستگاه اولتراسونیک^[۱۶] قرار گرفتند. سوسپانسیون به داخل لولههای فالکون ریخته شد و با سرعت ۱۵۰۰ دور در دقیق به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ گردید و محلول بالایی به داخل لوله‌های قهوه‌ای ریخته شد و نگهداری شد. تمامی مخلوط‌های دوتایی، سه تایی و چهارتایی از عصاره‌های گیاهی با نسبت‌های یکسان تهیه گردید. عصاره‌های انفرادی و مخلوط‌ها به نسبت ۱ به ۱۰ با حلال رقیق شد و برای آنالیزهای بعدی مورد استفاده قرار گرفت.
۳-۱-۳- اندازه گیری ترکیبات فنلی تام
ترکیبات فنلی تام به روش فولین سیو کالتو که توسط بامداد و همکاران [۲۲] شرح داده شده بود، اندازه گیری شد. نیم میلی لیتر از عصاره رقیق شد به داخل لوله‌های فالکون ریخته شد و با ۵/۲ میلی لیتر محلول فولین سیو کالتو رقیق شده (۱۰ درصد) مخلوط شد. ۲ میلی لیتر از محلول ۵/۷ درصد از کربنات سدیم به محلول نهایی اضافه شد و به مدت ۱۵ دقیقه در ۴۵ درجه سانتی گراد کشت شد و جذب نوری نمونه ها با دستگاه اسپکتروفتومتر^[۱۷] در طول موج ۷۵۶ نانومتر خوانده شد. ترکیبات فنلی تام معادل اسید تانیک بر هر گرم ماده خشک گیاه ، بیان گردید. اسید تانیک یک ترکیب فنلی می‌باشد.
۳-۱-۴- فعالیت زدودن رادیکالهای آزاد به روش DPPH
پنج میلی لیتر از محلول متانولی DPPHبه غلظت ۱/۰ میلی مولار به ۱/۰ میلی لیتر عصاره رقیق شده اضافه شد و پس از مخلوط نمودن ، لوله‌های حاوی مخلوط در دمای اتاق به مدت ۳۰ انکوبه شد و جذب نوری در طول موج ۵۱۷ نانومتر خوانده شد. فعالیت زدودن رادیکال آزاد طبق فرمول بامداد و همکاران [۲۲] به دست آمد.
۳-۱-۵- اندازه گیری قدرت احیا کنندگی
قدرت احیا کنندگی نمونه‌ها طبق روش پیشنهادی جایاپراکاشا و همکاران [۱۲۴] اندازه گیری شد. یک میلی لیتر از عصارههای رقیق شده به ۵/۲ میلیلیتر از محلول پتاسیم فری سیاناید یک درصد اضافه شد. مخلوط به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۵۰ درجه انکوبه شد و ۵/۲ میلی لیتر محلول ۱۰ درصد تری کلرو اسیتیک اسید به مخلوط اضافه شد و با سرعت ۵۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. ۵/۲ میلی لیتر از محلول بالایی به ۵/۲ میلی لیتر آب مقطر اضافه شد و ۵/۰ میلی لیتر کلرید آهن ۱/۰ درصد به آن اضافه گردید و جذب نوری در طول موج ۷۰۰ نانومتر خوانده شد.
۳-۱-۶- انداز گیری ظرفیت تام آنتی اکسیدانی
ظرفیت آنتی اکسیدانی تام به روش پریتو و همکاران [۲۲۱] اندازه گیری شد. احیای مولیبدن توسط عصاره‌ها و تشکیل ترکیب فسفومولیبدات سبز رنگ در شرایط اسیدی اندازه گیری شد. نمونه عصاره رقیق شده به مقدار ۱/۰ میلی لیتر با ۱۰ میلی لیتر از محلول واکنش که از ۶/۰ مولار اسید سولفوریک، ۲۸/۰ میلی مولار فسفات سدیم و ۴ میلی مولار مولیبدات آمونیوم تشکیل شده بود، مخلوط گردید. مخلوط نهایی به مدت ۹۰ دقیقه در دمای ۹۵ درجه سانتی گراد انکوبه گردید و پس از سرد شدن محلول در دمای اتاق، جذب نوری در طول موج ۶۹۵ نانومتر خوانده شد.
۳-۱-۷- اندازه گیری ممانعت پروکسیداسیون زرده تخم مرغ رقیق شده در بافر فسفات به روش تیوباربیتوریک اسید
اثرات ضد پروکسیداسیون عصاره‌ها طبق روش داکر و همکاران [۷۸] اندازه گیری شد. امولسیون ۵/۲ درصد زرده تخم مرغ در بافر فسفات ۱/۰ مولار تهیه شد و pH محیط به ۴/۷ تصحیح شد. پنج میلی لیتر از امولسیون با ۵/۰ میلی لیتر از محلول ۱/۰ مولار آهن مخلوط شد. عصاره‌های رقیق شد به مخلوط فوق اضافه شد و به مدت ۱ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شد. سپس ۵/۲ میلی لیتر از محلول ۱۵ درصد تری کلرو استیک اسید و ۵/۰ میلی لیتر محلول یک درصد تیوباربیتوریک اسید که تازه تهیه شده بود اضافه شد. مخلوط به مدت ۱۰ دقیقه در آب جوش قرار گرفت و پس از سرد شدن با سرعت ۳۵۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. جذب نوری لایه رویی با طول موج ۵۳۲ نانومتر خوانده شد.
۳-۱-۸- محاسبات و آنالیز آماری
تمام آنالیزهای شیمیایی حداقل در ۳ تکرار انجام شد. تمام آنالیزهای مربوط به مقایسه اثرات آنتی اکسیدانی عصاره‌های انفردی توسط مدل خطی تعمیم یافته توسط نرم افزار آماری SAS ورژن ۱/۸ آنالیز شد. اثرات متقابل بین مخلوط‌های دوتایی، سه تایی و چهارتایی عصاره‌ها توسط مقایسات متعامد یا اورتوگنال بررسی گردید: بدین صورت که مثلاً برای مقایسات دوتایی، اثر آنتی اکسیدانی مخلوط دو عصاره با میانگین اثر آنتی اکسیدانی هر یک از دو عصاره مقایسه گردید. اگر اثر آنتی اکسیدانی مخلوط با میانگین دو عصاره برابر بود اثر تجمعی تعریف گردید و در غیر این صورت یعنی مشاهده تفاوت معنی دار بین اثر آنتی اکسیدانی مخلوط و میانگین دو عصاره، اثرات متقابل سینرژیسم یا آنتاگونیسم تعریف گردید. درصد پاسخ سینرژیسم و آنتاگونیسم مخلوطها از فرمول مقابل محاسبه گردید:
interaction percentage = [(R_obs–R_exp)/R_exp] × ۱۰۰,
R_obs = قدرت آنتی اکسیدانی مخلوط عصاره‌ها و R_exp = میانگین محاسبه شده از عصاره‌های انفرادی که در مخلوط شرکت داشتند.
اثرات تجمعی بدین سان تعریف گردید که بین میانگین حسابی پاسخ‌های آنتی اکسیدانی هر یک از گیاهان دارویی در مخلوط و پاسخ آنتی اکسیدانی مخلوط گیاهان دارویی تفاوت معنی داری مشاهده نگردید. اثرات سینرژیسم این‌گونه تعریف شد که پاسخ آنتی اکسیدانی مخلوط گیاهان دارویی در مقایسه با میانگین حسابی هر یک از گیاهان دارویی در مخلوط، بیشتر بود. اثرات آنتاگونیسمی این‌گونه تعریف شد که میانگین پاسخ آنتی اکسیدانی مخلوط گیاهان دارویی در مقایسه با میانگین حسابی هر یک از گیاهان دارویی در مخلوط، کمتر بود.
۳-۲- مواد و روش های مربوط به آزمایش دوم
۳-۲-۱- محل اجرای آزمایش، دام‌ها، جیره و تیمارها
این پژوهش در مزرعه آموزشی - پژوهشی لورک، وابسته به دانشگاه صنعتی اصفهان انجام گرفت که در ۴۰ کیلومتری جنوب غربی اصفهان (جاده نجف آباد به فولاد شهر) در عرض جغرافیایی ۳۲ درجه و ۳۲ دقیقه شمالی و طول جغرافیایی ۵۱ درجه و ۲۳ دقیقه شرقی قرار گرفته است. ارتفاع آن از سطح دریا ۱۶۳۰ متر بوده و دارای اقلیم نیمه خشک با تابستان‌های خشک است.
در این آزمایش ۲۰ راس گاو هلشتاین خشک چند شکم زایش با میانگین وزن ۷۲۷ کیلوگرم و نمره بدنی ۶/۳ و ۱۲ راس گاو هلشتاین شکم اول زایش با میانگین وزن ۶۰۸ کیلوگرم و نمره بدنی ۲۶/۳ استفاده شد. گاوها بر اساس شکم زایش (چند شکم و یک شکم زایش) و زمان تخمینی زایش به طور تصادفی به تیمارهای آزمایشی اختصاص یافتند. تیمارهای آزمایشی بشکل فاکتوریل ۲×۲ شامل فاکتور منبع دانه روغنی ( کتان یا سویای اکسترود شده) و فاکتور افزودن مخلوط گیاهان دارویی (حضور یا عدم حضور گیاه دارویی) در نظر گرفته شد. بنابراین تیمارهای آزمایشی به این صورت بودند: ۱- جیره بر پایه دانه کتان اکسترود شده و بدون مکمل گیاه دارویی، ۲- جیره بر پایه دانه کتان اکسترود شده و مکمل گیاه دارویی ۳- جیره بر پایه دانه سویای اکسترود شده و بدون مکمل گیاه دارویی و ۴- جیره بر پایه دانه سویای اکسترود شده و مکمل گیاه دارویی. اقلام تشکیل دهنده خوراک‌ها در جدول ۳-۱ و تجزیه شیمیایی آنها در جدول ۳-۲ نشان داده شده است. جیره‌ها توسط نرم افزار جیره‌نویسی گاوهای شیری دانشگاه کرنل تهیه گردیده و به صورت جیره‌های کاملاً مخلوط به گاوها تغذیه شد. در دوره قبل از زایش جیره‌ها به صورت یک وعده در روز و در دوره بعد از زایش به صورت دو وعده در روز به طور دسترسی آزاد (۵ تا ۱۰ درصد پس آخر) در اختیار گاوها قرار داده می‌شد. طی دوره آزمایشی گاوها دسترسی آزاد به آب داشتند. مخلوط کتان اکسترود شده^[۱۸] از ۴/۵۸ درصد دانه کتان اکسترود شده تشکیل شده بود.مقدار چربی مخلوط دانه کتان اکسترود شده ۷/۲۵ درصد و حاوی ۳/۵۱ درصد اسید چرب امگا-۳ و ۱۷ درصد اسید چرب امگا-۶ بود. مقدار چربی دانه سویای اکسترود شده ۷/۱۸ درصد بود که حاوی ۲/۴۸ درصد اسیدهای چرب امگا-۶ بود. مخلوط گیاهان دارویی از ۶۰ درصد رزماری، ۱۸ درصد دارچین، ۱۸ درصد زردچوبه و ۴ درصد جوانه میخک تشکیل شده بود. این مخلوط حاوی ۲/۶۷ گرم در کیلوگرم ترکیبات فنلی تام بود و مقدار گیاه استفاده شده به ازای هر راس دام ۱۵۰ گرم قبل و ۱۷۰ گرم بعد از زایش بود. مخلوط گیاهان دارویی آسیاب شده به صورت سرک به جیره‌ها اضافه شد و نظارت کافی جهت مصرف بیشتر آن صورت گرفت.
۳-۲-۲- ثبت داده ها، نمونه برداری ها و آنالیزهای شیمیایی
مقدار خوراک مصرفی و پس آخور هر گاو به صورت روزانه اندازه‌گیری شد. از خوراک و پس آخور به صورت هفتگی نمونه برداری شد و نمونه‌های دو هفته متوالی با هم مخلوط شد و ترکیب شیمیایی آن مشخص گردید. همچنین ۲۰ روز پس از زایش، ۴ روز متوالی نمونه خوراک و مدفوع ۳ ساعت پس از خوراک‌دهی صبحگاهی برداشته شد.
ماده خشک نمونه‌های خوراک و مدفوع توسط آون در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد و به مدت ۷۲ ساعت خشک شدند. سپس توسط آسیاب^[۱۹] با طوری ۱ میلی متری آسیاب شد. نمونه‌های آسیاب شده برای اندازه گیری پروتئین خام، عصاره اتری و خاکستر به روش ^[۲۰]AOAC [18] و فیبر نامحلول در شوینده خنثی و اسیدی به روش ونسوست و همکاران (۱۹۹۱) آنالیز شدند. خاکستر نامحلول در اسید خوراک و مدفوع به عنوان نشانگر داخلی برای اندازه گیری ضریب قابلیت هضم مورد استفاده قرار گرفت [۲۷۳]. غلظت کربوهیدرات‌های غیر فیبری (NFC) جیره‌های کاملاً مخلوط به روش تفاضل و با بهره گرفتن از معادله زیر به دست آمد:
NFC = 100 - (% NDF + % CP + % EE + % Ash)
گاوها ۳ بار در روز در ساعات ۰۰ :۱۰ صبح، ۰۰ :۱۸ عصر و ۰۰ :۰۲ شب شیردوشی می‌شدند. شیر تولیدی یک روز در میان در هر وعده شیردوشی ثبت ‌شد و به طور هفتگی از آن نمونه‌گیری (داخل ظروف پلاستیکی ۵۰ سی‌سی از پیش بر چسب زده شده حاوی دی کرومات پتاسیم) می‌شد. نمونه‌های مربوط به هر وعده شیردهی هر گاو برای تعیین میزان پروتئین، چربی، لاکتوز و کل مواد جامد با دستگاه میلکواسکن به آزمایشگاه شیر دانشگاه صنعتی اصفهان ارسال می‌شد. تولید پروتئین، چربی، لاکتوز و کل مواد جامد بر اساس شیر تولیدی و درصد این ترکیبات در شیر محاسبه گردید.
گاوها در روزهای ۲۴ و ۱۲ قبل از زایش، روز زایش و ۱، ۸، ۱۶ و ۲۵ روز پس از زایش وزن شدند. نمره بدنی در روز ورود گاوها به آزمایش، روز زایش و روز ۲۴ پس از زایش در مقیاس ۵ واحدی ثبت گردید. توازن انرژی طبق روش هایرلی و همکاران [۱۱۱] محاسبه گردید.
مایع شکمبه چهار ساعت بعد از وعده خوراک‌دهی صبح در روز ۲۵ پس از زایش توسط لوله مری که به پمپ مکنده متصل بود، گرفته شد. بخش اول مایع شکمبه دور ریخته شد و بخش دوم با پارچه متقال ۲ لایه صاف گردید و pH آن توسط دستگاه pH متر^[۲۱] اندازه گیری شد و به منظور توقف تخمیر، به هر میلی‌لیتر آن ۲۰ میکرولیتر اسید سولفوریک ۵۰ درصد اضافه شد و داخل لوله فالکون ۵۰ سی‌سی در فریزر ۲۰- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. اسیدهای چرب فرار نمونه‌ها پس از یخ‌گشائی و آماده سازی توسط دستگاه گاز کروماتوگرافی^[۲۲] با ستون fused silica^[23] به طول ۵۰ متر و قطر داخلی ۳۲/۰ میلی متر اندازه گیری شد. اسید کروتونیک به عنوان استاندارد داخلی و گاز نیتروژن به عنوان گاز حامل استفاده شدند. دمای اولیه و نهایی آون دستگاه گاز کروماتوگرافی به ترتیب ۵۵ و ۱۹۵ درجه سانتی‌گراد بود و دمای بخش تزریق و دتکتور دستگاه روی ۲۵۰ درجه سانتی‌گراد تنظیم گردید.
ظرفیت آنتی اکسیدانی مایع شکمبه به روش پریتو و همکاران [۲۲۱] و نیتروژن آمونیاکی و بخش نیتروژن پپتیدی + اسید آمینه‌ای مایع شکمبه به روشی که توسط کاردوزو و همکاران [۵۸] توضیح داده شده است اندازه گیری شد. تخمینی از تولید متان از فرمولی که توسط موس و همکاران [۱۸۱] ارائه شده است محاسبه گردید.