و تا حد کافی عمل همزدن انجام گردید. ترکیب درون لوله آمایش به مدت ۲ ساعت در تاریکی در دمای اتاق نگهداری شد و سپس جذب محلول در طول موج ۷۶۰ نانومتر، در اسپکترفتومتر خوانده شد. آب مقطر به عنوان شاهد استفاده شد.
مقدار کل ترکیبات فنولیک از روی معادله خط رسم شده بر مبنای اسید گالیک به صورت mg گالیک اسید بر گرم عصاره خشک شده بیان گردید. آزمون فولین، با سه تکرار انجام شد.
۳-۳-۲- رسم منحنی استاندارد برای رابطه جذب و غلظت اسید گالیک
محلولهای استاندارد در غلظتهای مختلف اسید گالیک (۰، ۳۰، ۷۰، ۱۱۰، ۱۵۰، ۱۹۰ و ppm220 در متانول ۸۰درصد) تهیه شد. ۱۰۰ میکرولیتراز هریک از محلولها را در لوله آزمایش وارد کرده و سایر مراحل را بر اساس قسمت قبلی انجام شد. آزمون جذب برای هریک از محلولهای استاندارد در سه تکرار انجام شد. بر اساس نتایج جذب خوانده شده منحنی جذب اسید گالیک با توجه به غلظتهای ساخته شده رسم شد و سپس مقدار کل ترکیبات فنولیک برای هر یک از عصارهها، بر اساس معادله خط منحنی جذب اسید گالیک محاسبه شد.
۳-۳-۳- تعیین فعالیت آنتیرادیکالی
تعیین فعالیت آنتی رادیکالی از طریق آزمون DPPH و به وسیله معرف ۲و۲-دی فنیل پیکریل هیدرازین انجام می شود (۷۱) حجمهای بین ۱۰۰۰- ۱۰۰میکرولیتر از عصاره متانولی در رقت ppm200 (cc100/gr020/0) درون لوله آزمایش می ریزیم و بر اساس حجم عصاره اضافه شده، متانول ۸۰ درصد به آن اضافه می کنیم تا در کل حجم درون لوله آزمایش که شامل عصاره و متانول ۸۰ درصد می باشد به ۴ میلی لیتر برسد سپس به آن ۱۰۰۰ میکرولیتر محلول ۲و۲- دی فنیل پیکریل هیدرازیل[۱۲۴]، ppm120 اضافه شد (میکرولیتر ۱۰۰/gr012/0) و سپس به مدت ۳۰ ثانیه عمل همزدن را انجام شد. محلول حاصل را در تاریکی و در دمای اتاق به مدت ۱۱۵ دقیقه نگهداری میکنیم و سپس جذب نمونه را در ۵۱۷ نانومتر در دستگاه اسپکتروفتومتر Shimadzu گزارش می کنیم. دستگاه با متانول ۸۰ درصد کالیبره می شود نمونه شاهد که حاوی ۴ میلی لیتر متانول و cc1، ppm DPPH120 میباشد نیز بعد از ۱۱۵ دقیقه، جذب آن گزارش می شود.
فعالیت آنتی رادیکالی با بهره گرفتن از رابطه زیر محاسبه می شود:
| Abbsobance of control – Abbsorbance of sample | DPPH Scavenging= % |
| Abbsorbance of control |
نتایج به صورت IC50 گزارش می شود. IC50، غلظتی از عصاره است که میزان رادیکال های آزاد DPPH را به نصف کاهش دهد و به عبارت دیگر، IC50 غلظتی از عصاره است میزان جذب نمونه شاهد را که شامل DPPH است به نصف کاهش دهد. BHA به عنوان کنترل مثبت برای آزمون DPPH در نظر گرفته شد.
۳-۳-۴-آزمون رنسیمت:
به منظور پایداری اکسایش روغن از دستگاه رنسیمت ( Metrohm 743 ) استفاده شد. در این روش از شرایط تشدید‌شده اکسایش مانند دمای بالا و جریان هوا استفاده می‌شود. اکسایش نمونه‌ها در ظروف مخصوص و در محفظه مجهز به گرم‌کن انجام می‌شود. در این حال جریانی از هوا از محل واکنش اکسایش به ظرف محتوی آب هدایت و ضریب هدایت الکتریکی آب بر حسب میکروزیمنس بر سانتیمتر ( s/cmμ ) محاسبه می‌گردد. افزایش هدایت الکتریکی آب به عنوان شاخصی از پیشرفت اکسایش در نظر گرفته می شود. آزمون رنسیمت با تهیه غلظت ثابتی از عصاره در روغن سویای تصفیه بوگیری و رنگبری شده بدون آنتی‌اکسیدان ، تهیه و ۴ گرم از نمونه آماده شده به درون لوله‌های مخصوص دستگاه منتقل شد. پس از آن لوله‌ها در دمای ۱۱۰ درجه سانتی گراد و با شدت جریان هوای ۲۰ لیتر بر ساعت ، درون دستگاه قرار گرفتند. زمان لازم ، بر حسب ساعت ، برای رسیدن روغن به شرایط اکسید شده تحت عنوان دوره القا ( Induction Period ) بیان گردید(۲۹).
شکل ۳-۷ دستگاه رنسیمت
۳-۴- روش آماری
به منظور بررسی اثر متغیرهای ثابت مطالعه (دما، زمان و pH) بر روی مقدار ترکیبات فنولیک، قدرت رادیکال گیرندگی، پایدار کنندگی محیط روغن و همچنین بهینه‌سازی فرایند استخراج از روش سطح پاسخ استفاده شد و نرم افزار مورد استفاده Design Expert نسخه ۶.۱.۱ بود. مقایسات میانگین بین دو روش غرقابی و اولتراسوند به وسیله آزمون دانکن در طرح کاملا تصادفی و در سطح α=۰.۰۱ به وسیله نرم افزار sas.9.1 صورت گرفت.
فصل چهارم: نتایج و بحث
۴-۱- انتخاب بهترین مدل
پس از آنالیز داده‌ها توسط برنامه Design Export جهت تعیین بهترین مدل پیشنهادی از میان پنج مدل موجود Linear, 2FI, Quadratic, cubic, Mean با توجه به جدول تجزیه واریانس، مدلی که مقدار Sum of squar آن دارای اختلاف معنی‌دار بوده و مقدار Lack of fit آن معنی‌دار نشود به عنوان بهترین مدل انتخاب می‌شود.
با توجه به این موضوع و پس از بررسی نتایج بدست آمده و مقایسه میان مدلهای رگرسیونی نتایج حاکی از آن بود که مدل Quadratic برای تمامی آزمون‌های اندازه گیری شده در این مطالعه، دارای اختلاف معنی دار با سایر مدل‌ها بود.(جدول ۴-۱) و این مدل تنها مدلی بود که Lack of fit برای آن معنی‌دار نشده بود. در نتیجه مدل Quadratic برای بررسی روند تغییرات پارامترهای اندازه گیری شده در این مطالعه انتخاب شد.
پس از انتخاب بهترین مدل در سطح آماری مورد نظر (۹۹% یا ۹۵%)، جهت بررسی پارامترهای اثرگذار در مطالعه با توجه به جدول Anova ، پارامتری که آزمون F برای آن معنی‌دار نباشد (P>0.01) از مدل حذف می‌شود و سایر پارامترها که دارای اختلاف معنی‌دار در سطح (۹۹%) بودند در مدل نگهداری شد. لازم به ذکر است در صورتی که پارامتر خطی یک متغیر در یک مدل، اثر معنی داری نداشته باشد ولی اثر متقابل آن، با یکی از متغیرهای دیگر، که آن متغیر دارای اثر معنی‌داری در مدل بوده، دارای اثر معنی‌دار باشد آن پارامتر در مدل نگه داشته می‌شود و در سپس معادله کلی با بهره گرفتن از ضرایب داده شده برای هر پارامتری حاصل می‌گردد.
جدول ۴-۱Sum of squar-
| I.T | IC50 | T.P | Source | ||||
| Prob>F | Sum of square | Prob>F | Sum of square | Prob>F | Sum of square | ||
