Glucose= 20gr
Tween 80=1ml
Diamonium Hydrogen Citrate= 2gr
Sodium acetate= 5gr
Magnesium sulfate= 0.2 gr
Manganes= 0.04 gr
۳-۴-۲-۲- محیط کشت نرم MRS اگار
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت ۲/۵۲ گرم از محیط کشتMRS با ۶ گرم آگار را در یک لیتر آب مقطر جوشیده حل کرده و حرارت داده شود تا کاملا حل و شفاف گردد و سپس در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۶/۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردید.

۳-۴-۲-۳- محیط کشت MRS مایع
برای تهیه یک لیتر از این محیط کشت ۲/۵۲ گرم از محیط کشت MRS را دز یک لیتر آب مقطر حل کرده و بر روی هیتر گذاشته تا کاملا حل و شفاف گردد و سپس در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۶/۱ اتمسفر به مدت ۱۵ دقیقه اتوکلاو گردد.
۳-۵- کشت و آزمایشات تعیین هویت باکتری ها
ایزوله های مورد بررسی در این مطالعه که قبلا تحت عنوان گونه های لاکتوباسیل جداسازی شده بودند، در دمای ۸۰- درجه سانتی گراد نگه داری شده اند به منظور انجام این تحقیق از باکتری های مورد نظر با بهره گرفتن از محیط کشت MRS آگار کشت مجدد ( ساب کالچر) انجام داده تا کلنی تک بدست آید بعد از کلنی تک به صورت متوالی کشت انجام داده تا از خالص بودن باکتری اطمینان حاصل شود و سپس رنگ آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری مشاهده شود.
۳-۶- سنجش فاژ
۳-۶-۱- روش دولایه ای پلاک
در این روش فاژها توسط میتومایسین C القا می گردد ( فاز لیزوژنیک به فاز لیتیک فاژ تبدیل می شود). ابتدا ۱۰ میلی لیتر محیط کشت MRS آگار (میزان آگار ۵/۱ درصد می باشد) درون پلیت ها ریخته و پلیت ها به صورت آماده می باشد همانطور که قبلا ذکر شد. لوله هایی که حاوی ۵/۴ میلی لیتر محیط کشت نرم MRS آگار ( میزان آگار ۶/۰ درصد می باشد) می باشند را به دمای ۴۰ درجه سانتی گراد رسانده سپس ۱۰۰میکرولیتر (۰.۱ ml) CaCl₂ ۱۰Mm و ۵/۰ میلی لیتر میتومایسین C (0/2 mgr/ml ) و ۱/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری به آن تلقیح کرده لازم به ذکر است که همه ی این موارد باید به دمای ۴۰ درجه سانتی گراد رسیده باشند. لوله هایی که شامل تمام این محتویات می باشد را در سطح پلیت های MRS آگار پخش کرده به طوریکه تمام سطح را بپوشاند. سپس این پلیت ها را درون جار بی هوازی و داخل انکوباتور قرار داده و پس از ۲۴ ساعت پلاک ها مشاهده می شوند.
۳-۶-۲- مشاهده پلاک توسط القاء با پرتوUV
۵/۰-۱/۰میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری را در پلیت ریخته ( براساس میزان کدورت باکتری) و پلیت ها را در معرض تابش لامپ uv( 280 nm) قرار می دهیم. سپس۱/۰ میلی لیتر CaCl₂ (( ۱۰Mm و ۵/۹ میلی لیتر محیط کشت نرم MRS را در پلیت پخش کرده و پلیت ها را به صورت دورانی یا زیگزاک حرکت می دهیم تا به طور یکنواخت پخش شوند. پلیت ها را دورن جار بی هوازی و دمای ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ ساعت قرار می دهیم. سپس حضور یا فقدان پلاک را گزارش می کنیم.
شکل۳-۱ - پلاک
۳-۶-۳- آزمون Heap and Lawrence
تست فعالیت استارتر کالچر ^[۶۶] توسط هیپ و لورنس شرح داده شده است. لوله های حاوی ۵ میلی لیتر شیر پاستوریزه ( شیر کم چرب کاله) به مدت یک ساعت در۸۰ درجه سانتی گراد بخار داده شوند و سپس دمای آن را به ۳۰ درجه سانتی گراد می رسانیم. ۱/۰ میلی لیتر از سوسپانسیون باکتری را به لوله های حاوی شیر تلقیح کرده و سپس آن ها را گرماگذاری می کنیم. پروفایل انکوباسیون بدین صورت می باشد: ۱۰۰ دقیقه دمای ۳۰ ، ۱۹۰ دقیقه دمای ۴۰ و ۱۰۰ دقیقه دمای ۳۰. بعد از گرماگذاری PH نهایی بررسی می شود. اگر بعد از گرماگذاری PH به زیر ۶ تغییر نیابد و اسید تولید نشود به معنی حضور فاژ است. (۷۰،۳۷،۳۶)
۳-۷- سنجش حساسیت نسبت به آنتی بیوتیک
در این مطالعه تعیین حساسیت نسبت به ۲۲ گروه آنتی بیوتیک شامل پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها، آمینوگلیکوزید ها، گلیکوپپتید ها، ماکرولیدها، لینکوزامیدها، تتراسایکلین ها، کینولون ها و دیگر آنتی بیوتیک ها نظیر کلرامفنیکل، نیتروفورانتوئین، کوتریماکسازول و میتومایسینC با بهره گرفتن از روش دیسک دیفیوژن نسبت به این آنتی بیوتیک ها انجام گردید. در این روش از معیارهای CLSI استفاده شده است
جدول ۳-۳- دیسک های انتی بیوتیک مورد استفاده جهت آنتی بیوگرام در این مطالعه