هات پلیت (زیماژن-ایران)
بنماری (محصول شرکت بهداد)
میکروفیوژ ورتکس (mxcell)
هود لامینار کلاس ٢ یا هود PCR یا PCR Work Station(زیماژن)
سمپلرهای متغیر از١٠ تا ١٠٠٠ میکرولیتر(socorex)
سر سمپلر های کریستالی، زرد و آبی رنگ
دستکش­های لاتکس
رک سر سمپلر
روپوش
پارافیلم
تهیه محلول­های مورد نیاز
بافر )٨-۵/٧ TES (Tris-EDTA-Salt, pH;
برای تهیه این بافر ابتدا محلولهای زیر تهیه شدکه در زیرتوضیح هرکدام ازآنها آمده است:

) ٨-۴/٧ Tris-HC1(1M,PH:
١٢١/١۴گرم از Tris-HCl را در داخل آب مقطر حل کرده و سپس تنظیم ph با HCl صورت گرفت.
EDTA: (٠/۵M , PH:٨)
١/١٨۶ گرم دی سدیم اتیلن دی آمین تترااستات را که در ساختمانش حاوی ٢مولکول آب است در ml٨٠٠ آب مقطر ریخته و روی همزن مغناطیسی قرار داده سپس ph محلول را با بهره گرفتن از NaOH به ٨ رسانده، پس از حل شدن، حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسید . در نهایت محلول به دست آمده به کمک فیلتر میلی پور µm ٢/٠در زیر هود فیلتر شده و در حجم­های کوچک تقسیم و در یخچال نگه داری شد.
NaCl(۵M)
٢/٢٩٢گرم NaCl در ml ٨٠٠ آب مقطر حل شده و سپس حجم نهایی محلول به یک لیتر رسید.
جهت تهیه بافر Tris-EDTA-NaCl مقادیر ١٠ میلی لیترHCl-Trisr ١مولار، ٣٠ میلی لیتر EDTA5 مولار و ٣٠ میلی لیتر NaCl۵ مولار را مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم ١٠٠ میلی لیتر رسانده شد و سپس محلول مورد نظر به کمک فیلترمیلی پور استریل شد و با اسید به ۵/٧ pH= رسانده می شود.
SDS (١٠درصد)
١٠٠گرم SDS در ml٩٠٠ آب مقطر حل شده و تا ۶٨°c گرم شد. Ph محلول با بهره گرفتن از HC به ٧/٧ و حجم محلول با آب مقطر به یک لیتر رسید.
TE (١X, pH:٨) بافر
ML 1٠ از M) ۵ Tris-HCl ()را با ml٢ از M) ۵/٠EDTA () مخلوط کرده و حجم نهایی محلول با آب مقطر استریل به ١ لیتر رسانده شد و سپس به کمک فیلترمیلی پور استریل شد.
روش کار
(١) به مقدار ۵٠٠ میکرولیتر از خون حاوی EDTA، به مدت ١٠ دقیقه در ٨٠٠٠ دور در دقیقه^[۸۴] سانتریفیوژ شد تا سرم آن جدا گردد. (خون کهنه و فریز شده به دلیل لیز شدن نیازی به جداسازی سرم ندارد). سپس این سرم حذف گشت.
(٢) جهت لیز کرن گلبول­های قرمز خون، به میزان ١٠٠٠ میکرولیتر آب مقطر سرد به رسوب سلولی افزوده و پلیت سلولی در آن حل گردید. این عمل باعث می­ شود که گلبول­های قرمزو سفید بترکند و هسته­ها بیرون بریزند.
(٣) انجام مراحل ١ و ٢، تا سه مرتبه تکرار شد تا لایه سلولی با رنگ صورتی شفاف حاصل گردد که به معنای حذف کامل گلبول­های قرمز می باشد.
(۴) سپس ۵٠٠ میکرولیتر(TES)Tris-EDTA-salt اضافه و کاملا مخلوط گردید. در این مرحله گلبول های سفید لیز شده و رسوب به دست آمده کاملا به حالت محلول در می ­آید.
(۵) به محلول فوق ۵٠ میکرولیتر محلول سدیم دو دسیل سولفات^[۸۵](١٠ درصد) افزوده شد و بعد از اضافه کردن ١٠ میکرولیتر پروتئیناز K (٠٢/٠درصد) و بعد از اینورت کردن ملایم این مخلوط، درب میکروتیوپ ها با پارافیلم بسته شد و سپس بین ۴تا ٢۴ساعت در دمای ٣٧ درجه سانتیگراد در داخل بنماری قرار داده شد.
(۶) پس از خروج میکروتیوپ­ها از بن ماری، به میزان یک سوم حجم موجود (١۵٠میکرولیتر) محلول کلرید سدیم (NaCl) اشباع به آن افزوده شد تا رنگ آن کدر شود. در صورت عدم تغییر باید میزان NaCl را بیشتر کرد. عمل NaCl، کمک به رسوب پروتئین­هاست.
نکته: معمولا اولین حجم ٢۵٠ میکرولیتر خواهد بود که در اکثر موارد بعد از کمی تامل کدر می­ شود. در صورت نیاز هر بار به میزان ١٠ میکرولیتر اضافه می­گردد. چرا که، مقادیر اضافی NaCl در محیط، به عنوان مهار کننده PCR عمل می کند . (٧) پس از سانتریفیوژ در ٨٠٠٠ دور در دقیقه به مدت ٢٠ دقیقه، محلول رویی به یک لوله ی تمیز و استریل انتقال داده شد و به میزان حداقل ٧/٠حجم محلول (حدودا ۵٠٠ میکرولیتر) به آن ایزوپروپانل افزوده شد تا کلاف DNA ظاهر شود.
نکته: در مواردی که کلاف دیده نمی­ شود می­توان محلول الکل و DNA را برای یک ساعت در فریزر قرار داد تا کریستاله شدن تسریع گردد.
(٨) مجددا میکروتیوپ­ها در ٨٠٠٠ دور در دقیقه و به مدت ٣٠ ثانیه تحت سانتریفیوژ قرار گرفتند و سپس مایع رویی حذف گردید.
(٩) با هدف شستشو، ١٠٠ میکرولیتر اتانول ٧٠درصد به رسوب فوق افزوده شد و سانتریفیوژ گردید. این مرحله، جهت حذف نمک­های باقی مانده، که مانع PCR هستند، ٣ مرتبه تکرار می­ شود .
(١٠) سپس، درب میکروتیوب باز گذاشته شد تا الکل باقیمانده تبخیر شود.
می­توان از ترموبلاک با دمای ٣٧درجه سانتیگراد هم استفاده کرد. البته باید توجه داشت که مدت زمان استفاده نباید زیاد باشد در غیر این صورت DNA بیش از حد خشک می­ شود.
(١١) با توجه به حجم DNA بین ١٠٠ تا ٢٠٠ میکرولیتر آب مقطر استریل بدان افزوده شد تا DNA حل گردد و سپس در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شدند.
٢-٢-٣)روش استخراج DNA با بهره گرفتن از کلروفرم:
مواد لازم:
آب مقطر
NaCl اشباع (۶مولار)
N-Lysis
کلروفرم
اتانول ١٠٠%
اتانول ٧٠%