۳-۴-۳الکتروفورزژل آگارز
الکتروفورز روشی است که در آن مولکول های DNA با بار منفی در میدان الکتریکی قرار می گیرند.
مولکول های DNA از میان شبکه ژل آگارز به سمت قطب مثبت حرکت می کنند که سرعت حرکت مولکول ها وابسته به اندازه قطعات DNA می باشد.
به منظور حصول اطمینان از تکثیر ناحیه مورد نظر در DNA، پس از انجام فرایند PCR محصولات در ژل آگارز ۱ % الکتروفورز شدند.
بدین ترتیب ۶ % آگارز وزن شد و در ۶۰ میلی لیتر TBE IX به کمک حرارت حل شد ۵/۱ میکرو لیتر اتیدیوم برو ماید اضافه می کنیم. بعد از خنک شدن، محلول حاصل در سینی مخصوص که شانه در آن قرار داده شده بود ریخته شد. پس ژل برای بسته شدن درون یخچال قرار گرفت. بعد از قرار دادن ژل درون دستگاه الکتروفورز ۳ میکرولیتر از محصولات PCR درون چاهک های افقی ژل تزریق شد. همچنین درون یکی از چاهک ها Ladder تزریق شد.

دستگاه الکتروفورز افقی (GeL XL Ultrauk) که با TBE IX برشده است به مدت ۱ ساعت بر روی ۷۵ ولتاژ تنظیم شد.
بعد از اتمام کار برای مشاهده ژل از دستگاه UV Light استفاده شد. باید توجه داشت که وجود باند در ستون کنترل منفی نشان دهنده آلودگی در محلول PCR و یا حین کار است.
براساس نوارهای وزنی Ladder بر روی ژل می توان به طول قطعه تکثیر شده پی برد.
تصویر ژل آماده شود.

شکل ۱-۶ nrDNA IT’S حاصل از تکثیر DNAژل الکتروفورز محصول
به طور کلی آغازگرهای PCR، براساس نواحی بسیار حفاظت شده ای طراحی می شوند که در دو سوی نواحی بسیار متغیر قرار دارند. مثلا آغازگر trn-c مورد استفاده در این مطالعه دارای ژن trnF (GAA) می باشند که ضمن انجام فرایند PCRمطابق شکل۱-۷ به جایگاه های مربوطه متصل شده و ناحیه مورد نظر را تکثیر می کنند.
شکل ۱-۷ ناحیه فاصله گر رونویسی شونده داخلی (nrDNAITS)، زیر واحد ها، جهت و موقعیت آغاز گرها نشان داده شده است (برگرفته از Soltis et al., ۱۹۹۸).

شکل ۱-۸. ناحیه توالی DNA کلروپلاستی دو منطقه ی غیر کد شونده: اینترون trnL و فاصله گر بین ژنی trnL-F، جهت و موقعیت آغازگرها نشان داده شده است (برگرفته از (Quanddt et al., 2004.
۳-۴-۴تعیین توالی مناطق تکثیر شده
محصولات PCRتک باند قوی و بدون کشیدگی ، جهت تعیین توالی از طریق شرکت ژن فن آوران به کشور کره فرستاده شد. برای تعیین توالی نمونه های مربوط به nrDNAITS از آغازگرهای ITS5 یا ITS5m وI4 یا AB101F و AB101R استفاده گردید
۳-۵آنالیز فیلوژنی
برای آنالیز داده های مولکولی، کروماتوگرام های حاصل از تعیین توالی نمونه ها با بهره گرفتن از نرم افزار Bioedit ویرایش و به text تبدیل شد و سپس به دو طریق دستی و با بهره گرفتن از نرم افزار ClustalW (Thompson et al., 1994) هم ردیف سازی گردید. با روش بیشینه ی صرفه جویی (Maximum parsimony) با بهره گرفتن از نرم افزار PAUP*4.0bl0 (Sowfford, 2002) و همچنین با روش Bayesian با نرم افزارversion 3.12) MrBayes Ronquist & Huelsenbeck, 2003) آنالیز شدند.

شکل ۱-۹ کروماتوگرام حاصل از تعیین توالی قطعه - شکل nrDNA ITS
۳-۵-۱روش ماکزیمم پارسیمونی
بر اساس روش پارسیمونی مناسب ترین درخت، درختی است که به حداقل تعداد تغییرات برای توضیح داده ها (توالی های نوکلئوتیدی) نیاز داشته باشد و بنابراین بهترین درخت، کمترین تغییرات را در مسیر تکامل طی کرده و کمترین میزان هموپلازی ناشی از همگرایی یا برگشت را دارد و کوتاهترین درخت است.
در آنالیز پارسیمونی ممکن است چند کوتاهترین درخت به دست آید، در این صورت درخت توافقی (strict consensus tree) آنها را نشان می دهند که در این درخت کلادهای مشترک بین آن درختان نشان داده می شود ولی روابط ناسازگار بین آنها به صورت پلی تومی دیده می شود (Hall, 2001, Soltis & Soltis ,2003).
برای آنالیز داده های nrDNAITS، cpDNAtrnL-F و ترکیب ایندو، از جست و جوی ابتکاری (Heuristic search) و روش تبادل شاخه ای (Swapping)، دو نیمه سازی درخت و اتصال مجدد شاخه
هاTree Bisection Reconnection (TBR) و گزینه چندین درخت (MULTrees) با ۱۰۰ تکرار از Random addition sequences و MaxTrees = 20000 (بیشینه درختان ذخیره شده) استفاده گردید.
برای تعیین حدود اطمینان کلاد ها در درخت مطلق مرکزی (Strict Consensus) حاصل از هر یک از آنالیز های مذکور، آنالیـز (Felsenstein 1985) Bootstrap با روش جستجوی ابتـکاری و انتخاب گزیـنه های Simple addition sequences و TBR و با انتخاب گزینه off برای MULTREES، انجام شد. تعداد تکرارها در تمامی آنالیزهای Bootstrapping، ۲۰۰۰۰ تکرار در نظر گرفته شد. بیشینه ی درختان ذخیره شده به ازای هر تکرار در تمامی موارد ۱۰۰ درخت انتخاب شد.
۳-۵-۲روش Bayesian
آنالیز Bayesian بر اساس قاعده آماری Bayes بنا نهاده شده است. در این قاعده برآمد نهایی آزمایش به انچه در مراحل قبلی رخ می دهند، بستگی دارد.
روش استنباطی Bayesian اخیرا به فیلوژنی راه یافته و یک ابزار قوی برای پاسخ به سوالات پیچیده در بیولوژی تکاملی است. Bayesian در فیلوژنی بر اساس کمیتی است که احتمال ثانویه نام دارد. در واقع تئوری Bayes، ترکیب احتمال اولیه (prior probability) از فیلوژنی(pr [Tree]) با احتمال (pr )، برای ایجاد یک احتمال ثانویه (posterior probability) بر درخت (pr [Tree / Data)
است (Hall ,2001, Soltis & Soltis, 2003, Huelsenbeck et al., 2001).
این روش بر مدل های تکاملی متمرکز می شود و تمامی مکان های جانشینی را بررسی می کند. برای آنالیز داده های nrDNAITS، cpDNAtrnL-F و ترکیب ایندو، مدلهای تکاملی با بهره گرفتن از برنامه MrModeltest version 2.3 (Nylander, 2004)، اجرا شده در MrMTgui (Nuin 2005) بر اساس معیار اطلاعاتیAkaike (AIC) (Posada & Buckley 2004) انتخاب شدند. برطبق این آنالیز، مجموعه داده ها با بهره گرفتن از مدلهای K81uf + I + G و SYM +I + G، به ترتیب برای داده های cpDNAtrnL-F و nrDNAITS آنالیز شدند. مجموعه داده های ترکیبی در دو بخش با بهره گرفتن از ترکیب مدلهای مشابه یا به عنوان یک بخش با مدل GTR + I + G آنالیز شدند. برنامه MrBayes version 3.12 (Ronquist & Huelsenbeck 2003) برای آنالیز های فیلوژنتیکی Bayesian استفاده شد. برای آنالیز بخش بندی شده (partitioned analysis) و غیر بخش بندی ((nonpartitioned data، اجازه داده شد تخمین های جانشینی ها و طول شاخه ها به طور مستقل در هر بخش متغیر باشد. احتمالات ثانویه بر روی پارامترهای مدل از داده ها با بهره گرفتن از پیش فرض های اولیه برآورد شدند. آنالیز های ترکیبی و جدا از هم در ۲ میلیون نسل تکرار شدند. ۴ زنجیره مارکوف مونته کارلو (MCMC) در یک زمان از یک درخت به طور تصادفی شروع به کار کرد. یک درخت را در هر ۱۰۰ نسل نمونه برداری کرد. درختان نمونه برداری شده بعد از رسیدن به فاز خطی (بعد از ۵۰۰۰۰۰ نسل یا ۵۰۰۰ نمونه) جمع آوری شدند و برای ایجاد یک درخت توافقی با بیشینه ۵۰%، همراه با ارزشهای احتمال ثانویه با استفاده ازTreeview (Page 1996) استفاده شدند.
۳-۵-۳مقایسه دو روش آنالیزی ماکزیمم پارسیمونی و Bayesian
در روش ماکزیمم پارسیمونی، بهترین تفسیر از درخت، ساده ترین تفسیر است. در این روش، درختانی انتخاب می شوند که حداقل تعداد تغییرات را داشته باشند. مزایای این روش این است که انتخاب درخت با کوتاهترین طول، تعداد جانشینی های نوکلئوتیدی و هموپلازی ناشی از تکامل موازی و برگشت را نیز به حداقل می رساند. این روش آنالیزی به آسانی در برنامه