علاوه بر این در زمان‌های ذکر شده از هر رقم نمونه‌هایی با وزن تر ۲۰۰ میلی گرم برداشته و سپس استخراج DNA از آنها صورت گرفت و با انجام PCR وجود ویروس در آنها مورد آنالیز قرار گرفت. بررسی عملکرد ارقام مختلف از نظر وزن قسمت‌های هوایی، وزن ریشه و وزن کل در برابر آلودگی به BCTIV، یکی دیگر از اهداف این پژوهش بود که به همین منظور در روز ۳۵ بعد از زمان مایه‌زنی قسمت‌های هوایی و ریشه بطور جداگانه از ناحیه طوقه جدا و بعد از شستشوی کامل ریشه‌ها به منظور حذف خاک اطراف وزن قسمت‌های هوایی و ریشه بطور جداگانه با ترازوی دقیق اندازه‌گیری شد. از آنجای که میزان رشد ارقام مختلف از نظر تولید قسمت‌های هوایی و ریشه متفاوت است داده‌های بدست آمده از هر رقم به داده‌های شاهد ( گیاه سالم) همان رقم تقسیم شد به این ترتیب امکان تاثیر پرمحصول یا کم محصول بودن یک رقم در نتایج بدست آمده از عملکرد ویروس از بین رفت و تنها عملکرد ویروس بر روی رقم محاسبه شد. داده‌های حاصل از بررسی شدت علائم، وزن قسمت‌های هوایی و وزن ریشه مورد تجزیه آماری قرار گرفت و از نتایج بدست آمده در تعیین میزان مقاومت ارقام مورد آزمایش نسبت به BCTIV استفاده شد. آزمایش ارزیابی مقاومت ارقام یازده‌گانه چغندرقند به BCTIV در چهار کشت متوالی مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۱۶ طرح آزمایش ارزیابی مقاومت سه رقم انتخابی چغندرقند در آلودگی انفرادی و مخلوط به BCTIV و BSCTV-IR
در این آزمایش از سه رقم Brigita ، Dorothea و ۷۲۳۳ استفاده شد. ملاک انتخاب این ارقام پژوهش فتاحی(۱۳۹۱) بود که رقم Brigita را به عنوان یک رقم خیلی حساس به BSCTV-IR، رقم Dorothea را بعنوان یک رقم حساس و رقم ۷۲۳۳ را بعنوان یک رقم متحمل معرفی نموده بود. واکنش این ارقام در برابر BCTIV مطالعه حاضر مشخص نبود.
گیاهچه‌های هر رقم چغندر‌قند به تعداد ۶ عدد برای هر تیمار در مرحله ۴ برگی انتخاب و به روش اگرواینوکولیشن با همسانه‌های عفونت‌زای BCTIV   و BSCTV مایه‌زنی شدند.

۶ گیاهچه از هر رقم با همسانه‌ی عفونت­زای BCTIV
۶ گیاهچه از هر رقم با همسانه‌ی عفونت­زای BSCTV-IR
۶ گیاهچه از هم رقم با مخلوط مساوی همسانه‌های عفونت‌زای BCTIV و BSCTV-IR
به‌منظور ارزیابی مقاومت سه رقم چغندرقند نسبت به آلودگی انفرادی و مخلوط BCTIV و BSCTV-IR سه آزمایش طراحی شد که شامل ارزیابی شدت علائم بیماری در روی ارقام بعد از ۲۱ و ۳۵ روز از زمان مایه‌زنی، ارزیابی عملکرد سه رقم نسبت به تولید قسمت‌های هوایی و ریشه و همچنین اندازه‌گیری غلظت هر دو ویروس در آلودگی‌های انفرادی و مخلوط همزمان با بهره گرفتن از آزمون Real time PCR بود.
در هر طرح، تیمارها شامل غلظت ویروس در آلودگی انفرادی به ویروس‌های BCTIV و BSCTV-IR و آلودگی­های مخلوط همزمان به هر دو ویروس بود.
پس از مایه‌زنی گیاهچه‌ها در مرحله ۶ برگی، شدت علائم بیماری در هر گیاهچه در زمان های ۲۱ و ۳۵ روز پس از مایه‌زنی و وزن ریشه و قسمت‌های هوایی در روز ۳۵ پس از مایه‌زنی اندازه‌گیری گردید. ارزیابی شدت بیماری با بهره گرفتن از یک مقیاس ترتیبی (Ordinal scale) در ۵ درجه از درجات صفر (فقدان علائم) تا ۴ مطابق با جدول شماره ۳-۱۰-صورت گرفت.
وزن قسمت‌های هوایی و وزن ریشه در برابر آلودگی‌های انفرادی به BCTIV و BSCTV-IR، و آلودگی مخلوط همزمان به هر دو ویروس در روز ۳۵ بعد از زمان مایه‌زنی با ترازوی دقیق اندازه‌گیری شد. از آنجای که میزان رشد ارقام مختلف از نظر تولید قسمت‌های هوایی و ریشه متفاوت است داده های بدست آمده از هر رقم به داده‌های گیاه شاهد خود آن رقم تقسیم شد. به این ترتیب امکان تاثیر پرمحصول یا کم محصول بودن یک رقم در نتایج بدست آمده از عملکرد ویروس از بین رفت و تنها عملکرد ویروس بر روی رقم محاسبه شد.
از گیاهان مایه‌زنی شده در بازه زمانی ۲۱ و ۳۵ روز پس از زمان مایه­زنی نمونه‌برداری شده و به جهت تعیین میزان غلظت ویروس در هر گیاه آزمون real time PCR انجام گرفت.
داده‌های حاصل از بررسی شدت علائم در زمان‌های ۲۱ و ۳۵ پس از زمان مایه‌زنی ، وزن قسمت هوایی و وزن ریشه در زمان ۳۵ بعد از زمان مایه‌زنی و آزمون PCR RT-برای تعیین غلظت هر ویروس در گیاهان بیمار مورد تجزیه آماری قرار گرفته (در بخش بعدی توضیح داده شده است) و از نتایج بدست آمده در تعیین میزان مقاومت ۳ رقم Brigita ، Dorothea و ۷۲۳۳ در شرایط مایه‌زنی بطور منفرد و بطور مخلوط به مقدار مساوی از همسانه‌های عفونت‌زای BCTIV و BSCTV-IR استفاده شد.
۳-۱۷- روش‌های تجزیه آماری
۳-۱۷-۱- تجزیه آماری داده‌های مربوط به شدت علائم بیماری ارقام یازده‌گانه چغندر‌قند مایه‌زنی شده با همسانه عفونت زای BCTIV
با توجه به بروز علایم بصورت پیچیدگی برگ‌ها و ایجاد برجستگی در رگبرگ‌ها و عدم امکان اندازه‌گیری مستقیم علایم، ارزیابی شدت بیماری هر ۵ بوته به عنوان یک تکرار در نظر گرفته شد و با توجه به اینکه برای هر رقم ۱۵ گیاه وجود داشت، برای هر رقم ۳ تکرار انتخاب شد. شدت بیماری با بهره گرفتن از یک مقیاس ترتیبی (Ordinal scale) در ۵ درجه شامل صفر (فقدان علائم)، درجه ۱ (علائم خیلی خفیف)، درجه ۲ (خفیف)، درجه ۳ (شدید)، درجه ۴ (خیلی شدید) طبق نمره دهی در جدول ۳-۱۰ یادداشت شد. پس از یادداشت برداری از شدت علائم بیماری در دو زمان ۲۱ روز و ۳۵ روز بعد از زمان مایه‌زنی شاخص بیماری (Disease Severity index ) با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد:
تبدیل شاخص شدت بیماری (Disease severity index, DSI) از حالت ترتیبی به حالت درصدی با بهره گرفتن از فرمول بدست آمد که در آن A، B،C ، D وE به ترتیب تعداد بوته‌های مربوط به نمره‌های ۰، ۱، ۲، ۳ و ۴ موجود در هر تکرار می‌باشد و N=A+B+C+D+E برابر تعداد کل گیاهان ارزیابی شده می‌باشد. در این آزمایش هر ۵ بوته یک واحد تکرار در نظر گرفته شد. عدد ۲۰ بیان شده در فرمول نیز بیانگر بیشترین میزان شدت بیماری است که ۵ بوته موجود در هر تکرار می‌توانند نشان دهند (بعبارت دیگر تمام ۵ بوته موجود در هر تکرار با توجه به جدول ۳-۱۰، درجه ۴ بگیرند. در این صورت ۲۰=۴*۵ بدست می‌آید). با توجه به اینکه تعداد بوته‌های کشت شده برای هر رقم ۱۵ عدد (۳ تکرار) بود بنابراین برای هر رقم سه عدد مربوط به DSI بدست آمد که با میانگین گرفتن از اعداد بدست آمده شدت بیماری برای هر رقم محاسبه شد. توزیع داده‌های شدت بیماری در مقیاس جدید با توزیع نرمال تقریب می‌شود و با نرم افزار SAS Institute (1999) بررسی گردید. برای گروه‌بندی ارقام مورد مطالعه از نظر مقاومت به بیماری با بهره گرفتن از شاخص شدت علائم بیماری به طور قراردادی ارقام در سه گروه قرار گرفتند:
شاخص شدت علائم بیماری کمتر از ۵۰/۰ گروه خیلی حساس
شاخص شدت علائم بیماری بین ۵۰/۰ الی ۷۵/۰ گروه حساس
شاخص شدت علائم بیماری بیش از ۷۵/۰ گروه متحمل
۳-۱۷-۲- تجزیه آماری داده‌های مربوط به وزن قسمت‌های هوایی، ریشه و کل گیاه ارقام یازده‌گانه چغندر‌قند مایه‌زنی شده با همسانه عفونت زای BCTIV
با توجه به اینکه داده‌های بدست آمده از وزن قسمت‌های هوایی و ریشه ارقام مختلف در روز ۳۵ بعد از زمان مایه‌زنی بیانگر تفاوت واقعی بین ارقام نبود و ابتدا باید اثر رقم از داده‌های بدست آمده حذف می‌شد وزن داده‌های بدست آمده از ۱۵ تکرار مایه‌زنی شده هر رقم به میانگین وزن ۳ گیاه شاهد از هر رقم تقسیم شد به این ترتیب داده‌های بصورت اعداد بین ۱ تا صفر بدست آمدند. این داده‌ها هرچه به سمت عدد صفر نزدیکتر باشند نشان دهنده کاهش بیشتر عملکرد رقم در برابر BCTIV می‌باشد بعبارتی اختلاف عدد بدست آمده با عدد ۱ نشان دهنده میزان کاهش وزن آن رقم است مثلا عدد ۷/۰ بیانگر کاهش ۳۰% از وزن رقم مورد نظر است. توزیع داده‌های وزن قسمت‌های هوایی و ریشه در مقیاس جدید با توزیع نرمال تقریب شد و با نرم افزار (۱۹۹۹) SAS Institute بررسی گردید. گروه‌بندی ارقام یازده‌گانه مورد مطالعه از نظر مقاومت به بیماری با بهره گرفتن از وزن قسمت‌های هوایی، ریشه و وزن کل گیاه به طور قراردادی ارقام در سه گروه قرار گرفتند:
شاخص وزن قسمت‌های هوایی، وزن ریشه و کل گیاه کمتر از ۵۰/۰ گروه خیلی حساس
شاخص وزن قسمت‌های هوایی، وزن ریشه و کل گیاه بین ۵۰/۰ الی ۷۵/۰ گروه حساس
شاخص وزن قسمت‌های هوایی، وزن ریشه و کل گیاه بیشتر از ۷۵/۰ گروه متحمل
۳-۱۷-۳ تجزیه آماری داده‌های مربوط به شدت علائم بیماری در آزمایش ارزیابی مقاومت سه رقم انتخابی چغندر‌قند مایه‌زنی شده با همسانه عفونت‌زای BCTIV و BSCTV-IR بطور انفرادی و مخلوط
با توجه به بروز علایم بصورت پیچیدگی برگ‌ها و ایجاد برجستگی در رگبرگ‌ها و عدم امکان اندازه‌گیری مستقیم علایم، ارزیابی شدت بیماری هر ۳ بوته به عنوان یک تکرار در نظر گرفته شد و با توجه به اینکه برای هر رقم ۶ گیاه وجود داشت برای هر رقم ۲ تکرار انتخاب شد، شدت بیماری ۳ بوته موجود در هر تکرار با بهره گرفتن از یک مقیاس ترتیبی (Ordinal scale) در ۵ درجه شامل صفر (فقدان علائم)، درجه ۱ (علائم خیلی خفیف)، درجه ۲ (خفیف)، درجه ۳ (شدید)، درجه ۴ (خیلی شدید) طبق نمره دهی در جدول ۳-۱۰ یادداشت شد. پس از یادداشت برداری از شدت علائم بیماری در دو زمان ۲۱ روز و ۳۵ روز بعد از زمان مایه‌زنی شاخص بیماری (Disease Severity index ) با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه شد:
تبدیل شاخص شدت بیماری (Disease severity index, DS) از حالت ترتیبی به حالت درصدی با بهره گرفتن از فرمول بدست آمد که در آن A، B،C ، D وE به ترتیب تعداد بوته‌های مربوط به نمره‌های ۰، ۱، ۲، ۳ و ۴ موجود در هر تکرار می‌باشد و N=A+B+C+D+E برابر تعداد کل گیاهان ارزیابی شده می‌باشد. در این آزمایش هر ۳ بوته یک واحد تکرار در نظر گرفته شد. عدد ۱۲ بیان شده در فرمول نیز بیانگر بیشترین میزان شدت بیماری است که ۳ بوته موجود در هر تکرار می‌توانند نشان دهند (بعبارت دیگر تمام ۳ بوته موجود در هر تکرار با توجه به جدول ۳-۱۰، درجه ۴ بگیرند در این صورت ۱۲=۳*۴ بدست آید). با توجه به اینکه تعداد بوته‌های کشت شده برای هر رقم ۶ عدد بود ( ۲ تکرار) بنابراین برای هر رقم دو عدد مربوط به DSI بدست آمد که با میانگین گرفتن از اعداد بدست آمده شدت بیماری برای هر رقم محاسبه شد. توزیع داده‌های شدت بیماری در مقیاس جدید با توزیع نرمال تقریب می‌شود و با با نرم افزار (۱۹۹۹) SAS Institute بررسی گردید. گروه‌بندی سه رقم مورد مطالعه از نظر مقاومت به بیماری با بهره گرفتن از شاخص شدت علائم بیماری به طور قراردادی ارقام در سه گروه مانند آنچه در بخش ۳-۱۷-۱ توضیح داده شده قرار گرفتند
۳-۱۷-۴- تجزیه آماری داده‌های مربوط به وزن قسمت‌های هوایی، ریشه و وزن کل گیاه سه رقم انتخابی چغندر‌قند مایه‌زنی شده با همسانه‌های عفونت زای BCTIV و BSCTV-IR بطور انفرادی و مخلوط
با توجه به اینکه داده‌های بدست آمده از وزن قسمت‌های هوایی و ریشه ارقام مختلف در روز ۳۵ بعد از زمان مایه‌زنی بیانگر تفاوت واقعی بین ارقام نبود و ابتدا باید اثر رقم از داده‌های بدست آمده حذف می‌شد وزن داده‌های بدست آمده از ۲ تکرار مایه‌زنی شده هر رقم به میانگین وزن ۲ گیاه شاهد از هر رقم تقسیم شده به این ترتیب داده‌های بصورت اعداد بین ۱ تا صفر بدست آمدند. توزیع داده‌های وزن قسمت‌های هوایی و ریشه در مقیاس جدید با توزیع نرمال تقریب می‌شود و با نرم افزار (۱۹۹۹) SAS Institute بررسی گردید. گروه‌بندی سه رقم انتخابی مورد مطالعه از نظر مقاومت به بیماری با بهره گرفتن از وزن قسمت‌های هوایی، ریشه و وزن کل گیاه به طور قراردادی ارقام در سه گروه مانند آنچه در بخش ۳-۱۷-۲ توضیح داده شد، قرار گرفتند.
فصل چهارم
۴-۱ ردیابی ویروس پیچیدگی ایرانی بوته چغندرقند(BCTIV) در ارقام یازده‌گانه چغندرقند پس از مایه‌زنی با همسانه عفونت‌‌زای این ویروس با بهره گرفتن از PCR
به منظور اطمینان از آلودگی گیاهان ارقام یازده‌گانه چغندر‌قند پس از مایه‌زنی با BCTIV و رد‌یابی دی. ان. ای. ویروس در داخل گیاه، از کلیه گیاهان در روزهای ۲۱ و ۳۵ بعد از مایه‌زنی دی. ان. ای. کل استخراج و از آن در واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز استفاده شد. وجود ویروس در گیاهان مایه‌زنی شده با تکثیر قطعه‌ای به اندازه ۶۸۲ جفت باز با بهره گرفتن از یک جفت آغازگر اختصاصی ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندرقند (BCTIV474^V وBCTIV1155^C)، (جدول ۳-۲) مورد بررسی قرار گرفت. نتایج آزمون PCR گیاهان کشت اول در شکل‌های ۴-۱ و ۴-۲ آورده شده است. الگوی الکتروفورزی مشابه‌ای از محصولات PCR گیاهان کشت‌های دوم تا چهارم مشاهده شد که نمایش داده نمی‌شود. این نتایج نشان داد که ژنوم این ویروس با شدت‌های متفاوت در گیاهان تمام ارقام بعد از مایه‌زنی با همسانه عفونت‌زای BCTIV تکثیر می‌یابد و هیچکدام از ارقام مورد مطالعه مصون از آلودگی به BCTIV نیست. لذا برای مقایسه واکنش ارقام یازده‌گانه چغندر‌قند در برابر BCTIV، از مقادیر کمی فنوتیپی این ارقام بر پایه نوع علائم و شاخص‌های وزن قسمت‌های هوایی و ریشه گیاهان مایه‌زنی شده ارقام و در نهایت برای مقایسه واکنش ۳ رقم انتخابی چغندر‌قند در برابر ویروس‌های BCTIV و BSCTV-IR بصورت انفرادی و برهمکنش این ویروس‌ها در آلوگی مخلوط ‌از میزان کمی ژنوم تکثیر یافته ویروس با بهره گرفتن از واکنش PCR در زمان واقعی در آن ۳ رقم انتخابی، (هر دو مورد در بخش های بعدی آورده شده است) استفاده شد.
۶۸۲ bp
۶۸۲ bp
شکل ۴-۱ نقوش الکتروفورزی محصولات PCR تکثیر شده از دی.‌ان.‌ای استخراج شده از گیاهان ارقام کشت شده (کشت اول) با بهره گرفتن از جفت آغازگرBCTIV474^V/BCTIV1155^C (جدول ۳-۲) ۲۱روز بعد ازمایه زنی (شکل بالا) و ۳۵ روز بعد ازمایه زنی (شکل پایین). راهک‌ ۱: رقم Flair، راهک‌۲: رقم Rosier، راهک‌۳: رقم Isella، راهک ۴: رقم جلگه، راهک ۵: رقم ۷۲۳۳، راهک ۶: رقم Dorothea، راهک ۷: رقم Brigita، راهک ۸: رقم ۰۰۷(اکباتان)، راهک ۹: رقم ۰۰۶ (تربت)، راهک ۱۰: رقم ۰۰۵ (پارس)، راهک ۱۱: رقم ۰۰۴ ، راهک +: کنترل مثبت (پلاسمید حاوی ژنوم کامل ویروس)، راهک -: چغندرقند سالم، M: مارکر (DNA ladder Mix, Invitrogen).
۴–۲ واکنش فنوتیپی ارقام چغندر قند پس از مایه زنی با سوسپانسیون باکتری حاوی همسانه عفونت زای BCTIV
۲۱ و ۳۵ روز بعد از مایه‌زنی ۱۱ رقم چغندر‌قند مورد آزمایش } Brigita ، Dorothea، Rosire، Isella، Flair، jolge، ۷۲۳۳، ۰۰۶ (تربت)، ۰۰۴، ۰۰۵ (پارس)، ۰۰۷ (اکباتان){ با سوسپانسیون باکتری حاوی همسانه عفونت‌زای BCTIV، گیاهان از لحاظ بروز علائم بیماری پیچیدگی چغندر‌قند مورد بررسی قرار گرفتند و از نظر شدت علائم ایجاد شده با استناد به جدول شماره ۳-۱۰ به ۵ گروه به ترتیب شامل فاقد علائم، خیلی خفیف، خفیف، شدید و خیلی شدید دسته‌بندی شدند (شکل‌های ۴-۳).
AA
B
CC
D44
E
شکل۴-۲ شدت علائم بیماری پیچیدگی بوته چغندرقند در ۵ درجه شامل فقدان علائم (A)، علائم خیلی خفیف (B)، علائم خفیف ©، علائم شدید (D) و علائم خیلی شدید (E)که بعنوان مثال به ترتیب در گیاهچه‌های چغندرقند ارقام ۷۲۳۳ (A)، Flair(B)، Isella ©، Dorothea (D) و Brigita (E) 35 روز بعد از زمان مایه زنی با همسانهٴ عفونت زای BCTIV مشاهده شد. نمره دهی شدت علائم بیماری در جدول ۳-۱۰ آورده شده است.
واکنش کمی فنوتیپی در گیاهان ارقام یازده‌گانه چغندر‌قند (هر رقم ۱۵ گیاه) بر پایه نوع علائم ایجاد شده درآنها ۲۱ و ۳۵ روز پس از مایه‌زنی با سوسپانسیون باکتری حاوی همسانه عفونت‌زای BCTIV با استناد به جدول شماره ۳-۱۰ به ترتیب از کشت اول تا کشت چهارم در جدول‌های ۴–۱ تا ۴-۴ نشان داده شده است.